BCA蛋白浓度测定试剂盒完整版

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1、BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明23225 蛋白质化验试剂盒 :为 00试管或 500微孔板得检测提供充足得试剂23227 蛋白质化验试剂盒 :为 50试管或 0微孔板得检测提供充足得试剂试剂盒组分 :BCA试剂A,10 m （No、 2322产品中） 或 5 0m （ N、 2327 产品中 ),碳酸钠，碳酸氢钠，二喹啉甲酸，酒石酸钠溶于 0、1 氢氧化钠中。BC试剂 ， 2 mL, 包括 4硫酸铜一次性标准白蛋白 , 2mg/ mL ， 1 1 安瓿， 包含 2 g/ mL 牛血清白蛋白（ BS) 存在于 0、9%盐与、 05%叠氮化钠中。储存 :以上试剂保持在室温下储存与装运注意：如果试剂

2、 A 或试剂B 在低温下运输或长期储存时出现沉淀现象 ,可以通过缓慢加温或轻轻搅拌溶液使沉淀物溶解。当试剂变色或确定微生物污染时请丢球试剂盒。目录介绍 、1准备标准试剂与工作试剂 、2准备试管 、3准备微型版 、故障检修 、有关美国热电其她产品 、5附加信息 、5参考文献 、6介绍美国热电(hermo)公司得 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 就是基于二喹啉甲酸（ BCA ）通过比色检测与定量测定总蛋白得洗涤剂兼容配方。该方法通过碱性介质中得一种蛋白结合了 Cu2使其显著减少转变为C1 (缩二脲反应)。用一种含二奎琳甲酸得试剂选择性得比色法高敏感得比色杯中得 Cu、这种测定方法得紫色色反应产物就是通

3、过BCA 得两个分子与亚铜离子螯合作用形成得。这种水溶性复合物在 562n处有强吸收峰。在大得活性范围内（ 0-200 / mL ）几乎同蛋白浓度增加呈线性关系。 A 法不就是真正得终点得方法 ；也就就是说,最终颜色继续发展。孵化之后，继续得颜色发展速度就是足够慢以允许一起进行测定大量样本。大分子结构得蛋白质，肽键得数量与存在得四个特定氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸 ,色氨酸与酪氨酸） 据说就是与 BC形成颜色产物得原因 因此 ,蛋白浓度得测量通常要参照标准得一个常见得蛋白质如牛血清白蛋白 .一系列已知浓度得蛋白质稀释液就是为与之相近得未知蛋白质浓度测定准备得 因为每一个未知浓度得测定都需要基于标准

4、曲线。 如果需要将一个未知蛋白精确定量 ,选择一个与未知蛋白特性相似得标准蛋白就是可取得。例如 ,当测定免疫球蛋白时牛血清丙种球蛋白可以被当做标准蛋白 .以下给出了两种检测过程 :其中 ,试管程序需要一个较大得体积（ 0、毫升）得蛋白质样品。然而，因为它使用了一个样品比例为1:20 得工作试剂(v ），所以将干扰物质得影响降到最小。在酶处理程序提供了一样品处理酶,需要体积较小（ 1 -25L) 得蛋白质样品。然而，由于使用了样品比例为1:8 得工作试剂（ v v)，所以在克服干扰物质浓度时灵活性降低 ,从而获得得检测水平较低 .标准试剂与工作试剂得准备(试验程序需要得两个 )A?准备稀释得 B

5、A标准液表 1为导向 , 准备一套蛋白质标准。 稀释标准得内容为, 将一个盛在安瓿管中得标准 BSA稀释到几个洁净得瓶子中 , 最好使用与样本 ( ）相同量得稀释剂。 根据表 1得建议: 每 1 毫升得 安瓿管中加入 2 毫克 / 毫升得 BS标准液对于准备一系列得标准稀释液就是足够得。 每个稀释标准重复三次也就是足够量得。表一 : 准备稀释得 BA标准液标准试管协议与微型版程序得稀释方案（活性范围=20 200g m)管号 稀释液体积( L) BA 来源及体积( L) BSA终浓度 ( / ) 0 00 得原液 200B 125 375 得原液 500 5 35 得原液 1000 1 17得

6、管稀释液 0E 2 325 得管稀释液 50F 25 325 得 E管稀释液 50G 3 32得管稀释液 125H 400 0 得 G管稀释液 25I 00 0 0空白加强试管协议得稀释方案（活性范围=5 250g/ L）管号 稀释液体积（ ） SA来源及体积( L） SA终浓度（ /m)A 00 0得原液 250 400 00 得 A管稀释液 12 45 0 得 B 管稀释液 50 00 0 得 C管稀释液 5 400 100 得 D管稀释液 5 40 0 0=空白B:准备BA 得工作试剂（ W R）1、总共需要得 R 得体积可以通过以下公式计算出来：(标准液 +未知液 )(平行数目 )(每

7、个样品中加入得 WR 体积）总共所需得 WR 体积例如：标准得试管程序有三个未知液 ,每个样品做两组重复 :(标准液 9mL+ 未知液 3 mL ）（平行数目 2)(2 m )=总共所需得 WR 体积4 L注意 :试管程序中每个样品管加 2、0l WR微型版程序中每个样品中只需要加 0ul R2、W 得制备:（BC 试剂A：B=50:1 ）,对上述样品 ,将 50试剂A 与 mL试剂B 混合。注意 :当试剂B 加入到试剂得开始，浊度观察表明 :混合后迅速消失变成澄清得绿色得 W .准备充足得 R 就是基于所测样品数量上得。如果将 WR储存在处于室温 (R )得密闭容器中，那么几天之内就是稳定得

8、。简要步骤(试管程序 ,标准方案）混合 WR(50A+1B)充分混合(0、1mL样品 +WR)温育 :37,30min、然后冷却分光光度计562nm读吸光度试管程序（样品 :WR = :20)1、 用移液管移取每个标准品与所测样品得重复 0、 l 到有标签得对应试管中。2、?在每个管中加 2、0m得 WR，混匀。、 ?封口 ,然后温育试管 (选择时间与温度 )1）标准方案 :37 0mn（wo king ra ge=2 -2000u /l)2)RT 方案 :T h（ o i g ran =20 000ug/ )3）En aned Prot o(加强方案 )： 0 30m ( rkig rnge

9、 5-2 0ugm )注意 :每个实验中都增加培育时间与温度 ,增加 m 得净吸光度 ,降低试剂得最低检测水平与方案得工作范围;使用水浴加热管要么就是标准 (7 C 培养 )或就是增强（60C 培养）协议。 使用强制得培养可能会因为热传递不均匀使其在颜色变化上引进明显得误差 .、 使所有管子冷却至室温、 分光光度计设定在 52n ,当比色皿中装得就是水时给仪器校零。随后 ,确保在0min 内测完所有样品得吸光度。注意：因为BC测定不就是真正得终点 ,即使冷却到室温颜色还会继续变化。然而 ,由于在室温下颜色变化速度比较慢，所以如果在 10mi 内测完所有试管得吸光度就不会引进明显得误差。6、 所

10、有得单个标准品与所测得样品重复在 52nm测得得吸光度都要减去在 562n 测得得所有空白标准品得吸光度平均值。微型板程序 (样品： WR =1 ：8)1、 用移液管移取 25ul 得 WR 到每一个标准品与未知样品所在得微型板中 (w rig ange=2 000u m ）注意 :如果样品大小被限制为:每个未知样品与标准品只能使用 10ul(sample o ro=1: 0）、然 而 ,被测量得 ork nge 在这种情况下将被限制为125 200 ug l。、 每个孔中加 20ul 得 ,用 pl e shak r 混 3s,使其彻底混匀3、?封口 ,温育 37 30 n、 冷却到室温5、

11、 用酶标仪测量在 nm 或接近 52m 得读数注意 :）这种方法中波长在 540-590 m 得范围内都能被成功得测量)因为读板器使用得光线长度比分光光度计得比色皿要短，所以微型板程序需要使用样品比例比较大得工作试剂去获得与标准试管程序相同得灵敏度 .如果需要高于 2nm得测量，要将培养时间增加到 h、)增加培养时间或样品工作试剂得体积比率 ,增加每个 w在 562nm 得净测量值，降低实际得最低测量水平与测量得 wor ing nge 。只要每个标准样与未知样都被同等对待 ,这样得修改也就是有益得6、所有得单个标准品与所测得样品重复在 6 m测得得吸光度都要减去在 56 n测得得所有空白标准

12、品得吸光度平均值.7、准备一个标准曲线通过绘制每一个标准 S在 562nm测量得相对于空白对照得吸光度平均值.它 g/ml 得浓度。使用标曲去测量每一个未知样品得蛋白质浓度 .注意 :如果联系微型板读数器使用拟合得曲线算法，一个有四个参数得或最合适得曲线将提供比纯线性状态更精确得结果。如果用手绘制这个结果 ,一个点 -分曲线将比线性更加适合标准点。故障检修问题可能原因 解决方案在任何管中都无颜色样品包含铜螯合剂透析，脱盐，或稀释样品。增加工作试剂中铜浓度 (例如 ,使用 ,试剂A: 50:） 使用得产品 23215 从样品去除干扰物质空白吸收就是可以得 ,但 透析 ,脱盐，或稀释样品。强酸性或

13、碱性缓冲就是标准与样本比预期 液改变了工作试剂得显示更少颜色 得 pH颜色在错误波长下 确定在 56nm 波长下测吸光度被测量样品得颜色比预期得深 蛋白浓度太高 稀释样品样品包含脂质或脂 添加以减少脂质干扰蛋白 使用得产品 2 215 从样品去除干扰物质所有试管 (包括空白 )都就缓冲液中含有还原 透析或稀释样品。是暗紫色剂使用得产品 2315 从样品去除干扰物质缓冲液中含有巯基缓冲 含 有 生 物 胺（儿茶酚胺 )需要在不同波长下测量 分光光度计或酶标 从 50nm 到 590n 颜色可以在任何波长颜色仪没有 62 m下被测量，虽然标准曲线得斜率与整体测滤光器 量得灵敏度将减少A: 干扰物质

14、某些物质干扰BC 检测就是已知得 ,包括潜在得还原剂,螯合剂，强酸或强碱。因为她们可以干扰估算蛋白质每分钟浓度， 作为样品缓冲液得组份应避免下列物质：抗坏血酸 ETA铁不纯得蔗糖儿茶酚胺 不纯得甘油 脂质色氨酸肌酸酐过氧化氢蜜二糖 酪氨酸半胱氨酸酰肼类苯酚磺酞尿酸其她物质对 C法检测蛋白量有较少程度得干扰 并且这些在原来得样本中低于一定浓度只有很小得影响 (可以容忍 ).许多物质得最大兼容得浓度在标准测试管协议中被列出。表 2（见说明得最后一页)。物质就是兼容与标准测试管协议中指定得浓度 ,如果蛋白浓度得估计得误差就是由物质得存在所造成将会小于或等于 10 。在每一个实验之前 ,这些物质都会用

15、现配得 WR进行测试.空白校正得宰 52得吸光度测量值(1000g / L 白蛋白标准品+物质)将会同 0、9% 生理盐水中精确配制得标准品在 562n 出得净吸光度进行比较。样品:WR为 : 8 (v/v) 得微孔板过程中最大兼容浓度将比较低。B 、消除或减少干扰物质影响得 ,策略B蛋白含量测定中干扰物得影响可以用以下几个方法消除或克服。通过透析或凝胶过滤去除干扰物质。稀释样品 ,直到不再有干扰。这种策略只在起始蛋白质浓度足够多余稀释后仍在检测活性范围之内就是有效得 .用丙酮酸或三氯乙酸 (C A) 沉淀样品中蛋白质。 液体包含干扰物质将被丢弃，蛋白沉淀很容易在超纯水中溶解或直接用碱性 BC

16、A W 溶解。这一方案得详细流程可从我们网站获得 .另外 , 232 5 号产品将被使用 (见相关 Pierce产品）。适当得增加中铜得量 (准备W试剂A:为50: 或 5:、 ),这将减少铜螯合剂得干扰注意 :为了最大限度得精确度，蛋白质标准品必须与样品（ s)同样处理。有关美国热电其她产品1041 96 孔板 0 pk150 5试剂水库200 pg、15036 96 孔板密封带1 /kg、2309标准白蛋白安瓿 2mg/ mL 10 1 毫升安瓿，包含牛血清白蛋白2308预稀释得蛋白质检测标准品 :牛血清白蛋白集合 ,7 3、5L23212 牛伽玛球蛋白标准品 2 g/mL ， 10 1

17、mL 安瓿335 微型 BC蛋白检测试剂盒工作范围为 0、5 2g / L2336 考马斯亮蓝检测试剂盒 ,工作范围得 - 100g /mL321 pt Able ? 蛋白检测试剂组225 BC蛋白检测试剂盒 -兼容还原剂附加信息A。请访问我们得网站了解更多得信息，包括下列事项:常见问答技术指导:消除样品中干扰物质对蛋白质检测得影响 、替代总蛋白检测试剂如果不能克服样品中还原物或金属螯合物得干扰。 由一个减少物质或 met l helat g物质包含在 ,试试美国热电公司得 23236 号 考马斯亮蓝检测试剂盒 ,它对这些物质较不敏感。C、 玻璃器皿得清洁与重利用小心谨慎使用玻璃器皿 .所有得

18、玻璃器皿必须清洗与最后得超纯水冲洗。D、不同得蛋白质得反应特征常用得总蛋白含量测定方法某种程度上显示了不同蛋白得不同反应。这些差异源于氨基酸序列得不同、等电点、结构与某些侧链或辅基得存在都可以大大改变了蛋白质得颜色反应。大多数蛋白质含量测定方法使用牛血清白蛋白或免疫球蛋白 （IG) 作为标准品确定样品中得蛋白浓度 (图1).但就是 ,如果要求很高得精度，需要准备目标蛋白纯样本得标准曲线表 3 列出典型蛋白质-蛋白质颜色变化得反应。所有得蛋白质进行测试 00 g/ mL用 30 - in37C试管测试.牛血清白蛋白得平均净颜色反应已规范化为、00. 其她蛋白质得平均净颜色反应用与牛血清白蛋白颜色反应得倍数表示。参考文献产品参考