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1、利用siRNA抑制人骨肉瘤细胞survivin的表达 08-05-08 09:29:00 编辑： studa20作者：李鲲，杨述华，刘红云，傅德皓，宁旭，梅荣成【摘要】目的 构建生存素（ survivin）短发夹状 RNA表达载体，检测其对骨肉瘤细胞 survivin mRNA 及蛋白表达的影响。方法体外构建 survivinshRNA 表达载体 pSilence2.1neosurvivin,转染骨肉瘤细胞系MG63，RTPCR、免疫组化方法检测转染前后survivin mRNA 及蛋白的表达， MTT比色法检测细胞增殖活性。结果pSilence2.1neosurvivin载体转染能显著抑制
2、survivin mRNA 、蛋白表达，转染后48h 细胞增殖的抑制率为61.83%。结论 pSilence2.1neosurvivin可显著抑制 MG63 细胞 survivinmRNA、蛋白的表达及细胞的增殖活性。【关键词】survivin；RNA干扰；短发夹RNA；骨肉瘤Inhibition of the Expression of survivin in Osteosarcoma Cell by A Short Hairpin RNAKey words：survivin；RNA interference； Short hairpin RNA；OsteosarcomaRNA干扰（ RNA
3、 interference，RNAi）是一种新兴的转录后基因阻断技术 ,可以简单、有效、特异地下调细胞中目的基因的表达。我们以靶点，体外构建短发夹状RNA的表达载体 ,观察其对 MG63 细胞survivin survivin为基因表达的影响，为骨肉瘤基因治疗的进一步研究提供实验基础。1材料与方法1.1材料人骨肉瘤细胞系 MG63 为本教研室保存， Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品， pSilence2.1neo 为 Ambin 公司产品， RTPCR试剂盒为 MBI 公司产品，鼠抗人survivin单克隆抗体及 SP试剂盒为 Santa Cruz公司产品。1
4、.2实验方法pSilence2.1neosurvivin表达载体构建及细胞转染参照 Harborth 等 1的干涉 RNA 设计原则，以人survivin的 mRNA序列 5 TTCGTCCGGTTGCGCTTTC3为靶点，体外合成两端带有 BamH和Hind粘端酶切位点、内含 5 TTCGTCCGGTTGCGCTTTTCAAGAGA GAAAGCGCAACCGGACGAA3 发夹状序列的双链 DNA，将合成的片段接入pSilence2.1neo 载体，筛选、扩增后经测序证实构建成功。分胞转染处理：空白组、脂质体组、空载体组、shRNA组。4 组进行细RTPCR检测细胞survivin mRN
5、A的表达分别收集转染24、48、 72h 细胞 ,提取细胞总 RNA，并进行逆转反应。引物的序列为：survivin：上游： 5ATGGGTGCCCCGACGTTG3下游： 5AGAGGCCTCAATCCATGG3，扩增产物 436bp。actin ：上游： 5TGGCATTGCCGACAGGATGCAGAA3下游： 5CTCGTCATACTCCTGCTTGCTGAT3，扩增产物 172bp。以 survivin与 actin条带的积分吸光度（ IA ）比值表示 survivin mRNA 的相对含量。免疫组化法检测survivin蛋白的表达按上法处理细胞24、48、 72h 后， SP法进行
6、免疫组化染色。以细胞浆和/ 或核呈现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，并计算阳性表达率：阳性表达率=（每 500 个细胞中阳性细胞数 /500 ） 100%。后，行OD值MTT法检测细胞增殖活性按上法处理细胞24、48、72、 96hMTT染色，测 OD值，计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=（空白组处理组 OD值） / 空白组 OD值 100%。1.3统计学处理采用 SPSS10.0统计软件，对数据进行t 检验。2 结果2.1RTPCR结果shRNA组 436 bp 处的条带亮度显著低于其余各组，见图1，与空白组相比 shRNA组 24、 48、72h mRNA表达抑制率分别为 68.52%、74.87%和 71.93%，其抑制作用在 2448h 逐步增加， 48 72h 有所减低，余各组之间无明显差别，见表 1。表 1 survivin shRNA 对 MG 63 细胞 survivin mRNA 表达的影响
利用siRNA抑制人骨肉瘤细胞survivin的表达.
