实验五重组DNA技术

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1、12复复 制制翻翻 译译转转 录录不同来源的不同来源的DNADNA分子通过磷酸二酯键连接成新的分子通过磷酸二酯键连接成新的DNADNA分子，分子，这一过程称为这一过程称为DNADNA重组。基因重组是自然界的一种常见现象，重组。基因重组是自然界的一种常见现象，是物种演变、生物进化的基础。是物种演变、生物进化的基础。不同来源不同来源的的DNADNA分子分子重组重组DNADNA分子分子基因重组基因重组3 在分子水平上在分子水平上, ,根据人们的需要以人工的方法取得感根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因兴趣的目的基因, ,在体外与载体在体外与载体DNADNA分子重组分子重组, ,然后将重组然

2、后将重组分子转入受体细胞分子转入受体细胞, ,并筛选出能表达重组并筛选出能表达重组DNADNA的活细胞的活细胞, ,加加以纯化、扩增，成为克隆。以纯化、扩增，成为克隆。 克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。如细克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。如细菌克隆、动物克隆和分子（菌克隆、动物克隆和分子（DNADNA）克隆等。）克隆等。Restriction enzymes: 选（分）选（分）切切接接转转筛筛扩扩重组重组DNADNA技术的基本过程技术的基本过程5其作用是：其作用是：n携带目的基因携带目的基因DNADNA（或外源（或外源DNA)DNA)进入宿主细胞（大肠杆进入宿主细胞（大肠杆

3、菌，哺乳动物细胞等）。菌，哺乳动物细胞等）。n使外源使外源DNADNA在宿主细胞复制扩增或表达。在宿主细胞复制扩增或表达。 载体的选择载体的选择常用载体：常用载体：质粒质粒DNADNA，噬菌体，噬菌体DNADNA，病毒，病毒DNADNA61能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA片段片段一同扩增；一同扩增；2有合适的限制性酶切位点便于进行克隆；有合适的限制性酶切位点便于进行克隆；3载体分子应尽量小，可插入较大的外源载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影而不影响复制；响复制；4有一定的筛选标记，易于识别和筛选；有一定的筛选标记，易于识别和筛选；5表达

4、型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件；导序列、增强子等调控元件；6生物安全性好。生物安全性好。 载体的选择标准载体的选择标准7insertBamHIreplication8存在于细菌染色体外的小存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链的共价、闭环双链DNADNA分分子。子。 （1）9本实验应用的质粒本实验应用的质粒10质粒质粒DNADNA的提取和鉴定的提取和鉴定n碱裂解法抽提质粒碱裂解法抽提质粒DNA: 利用基因组利用基因组DNA和质粒和质粒DNA变性和复性的差变性和复性的差异来分离提取质粒。异来分离提取质粒。在在pH高达高

5、达12.6的条件下，染色体的条件下，染色体DNA的氢键断的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸的醋酸钾高盐缓冲液调节其钾高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构又恢复原来的构型。而染色体型。而染色体DNA不易复性而形成缠连的网状结构。不易复性而形成缠连的网状结构。n进一步用氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，用无水乙醇沉淀质粒进一步用氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，

6、用无水乙醇沉淀质粒DNA，可得到纯化的质粒可得到纯化的质粒DNA。11 将菌液倒入将菌液倒入1.5ml离心管中离心管中(尽量倒满尽量倒满) 12000rpm /30s (沉淀菌体沉淀菌体) 在原管中重复上述操作在原管中重复上述操作1次次 弃上清扣干弃上清扣干,加入预冷的加入预冷的solution 100L,剧烈振荡打散菌体剧烈振荡打散菌体, 冰浴冰浴5min （以下操作要轻柔）（以下操作要轻柔） 加入新配制的加入新配制的solution 200L,温和颠倒离心管温和颠倒离心管23次混匀，室温放置次混匀，室温放置5min （此时液体应由混浊变为透明粘稠）（此时液体应由混浊变为透明粘稠） 加入预冷

7、的加入预冷的solution 150L, 温和颠倒离心管温和颠倒离心管23次混匀，冰浴次混匀，冰浴5min 离心离心12000rpm/5min 小心将含有质粒小心将含有质粒DNA的上清移至另一离心管中的上清移至另一离心管中 加等体积氯仿加等体积氯仿,轻微振荡，离心轻微振荡，离心12000rpm /2min 转移上清液至另一离心管转移上清液至另一离心管 加入加入2倍体积冰冷无水乙醇倍体积冰冷无水乙醇,轻轻混匀室温放置轻轻混匀室温放置2分钟分钟 离心离心12000rpm /5min 弃上清弃上清,加入加入70%乙醇洗涤沉淀，离心乙醇洗涤沉淀，离心12000rpm /2min，弃上清，弃上清 重复洗

8、涤重复洗涤1次次弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干 室温放置室温放置15min干燥干燥 加入加入1TE 30L 溶解质粒溶解质粒,用于定量分析、电泳检测等。用于定量分析、电泳检测等。12nSolution I 中的中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对酶的活性，对DNA起到保护作起到保护作用。加入用。加入solution后一定要充分打散菌体。后一定要充分打散菌体。nSolution II要新鲜配置要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱

9、性。加入减弱碱性。加入solution II后放置时间不要超过后放置时间不要超过5min，以，以免变性质粒不易复性。免变性质粒不易复性。n加入加入solution II后液体应由混浊变为透明粘稠，可见拉丝后液体应由混浊变为透明粘稠，可见拉丝现象。若没有上述现象发生，则实验不能继续下去，应检现象。若没有上述现象发生，则实验不能继续下去，应检查试剂配制及操作是否有误，然后重新开始。查试剂配制及操作是否有误，然后重新开始。n质粒质粒DNA提取过程中动作要轻柔，以免对提取过程中动作要轻柔，以免对DNA造成损伤。造成损伤。13为什么用无水乙醇沉淀为什么用无水乙醇沉淀DNADNA？ n这是实验中最常用的沉

10、淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。nDNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。14琼脂糖凝胶电泳检测质粒琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA DNA的电泳原理与蛋白质电泳基本相同。在pH高于其pI时，DNA分子带负电荷，在直流电场中DNA向正极泳动。不同的DNA分子因所带电荷、构象和分子量大小不同，在同一电泳系统中的泳动速度存在差异，因而可以使核酸片段彼此分离，并检测其分子大小。电

11、泳后的凝胶浸泡于荧光染料（如溴化乙锭）中，染料分子可嵌入DNA分子碱基之间，在紫外线照射下发出荧光，可观察到核酸片段所在的位置和亮度，从而对DNA进行定性或定量测定。 15琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶分离范围 琼脂糖浓度琼脂糖浓度% % 线状线状DNADNA分子分离范围分子分离范围KbKb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2琼脂糖凝胶的浓度可根琼脂糖凝胶的浓度可根据据DNA分子的大小来确分子的大小来确定，一般基因组定，一般基因组DNA可可用用0.8%琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶进行电泳检测，质粒电

12、泳检测，质粒DNA选选择择1琼脂糖凝胶，而琼脂糖凝胶，而对只有几百个碱基对的对只有几百个碱基对的寡核苷酸可制备浓度更寡核苷酸可制备浓度更高一些的琼脂糖凝胶。高一些的琼脂糖凝胶。161凝胶板的制备2灌胶3待胶凝固完全后，将铺胶的有机玻璃胶槽放在电泳槽中，加入0.5TBE电泳缓冲液，液面高于凝胶面约0.5cm ，轻轻拔出梳子。4加样：将质粒DNA作为上样样品。将样品10L和上样缓冲液6：1混匀，用微量加样器将样品分别加入胶板的样品小槽内（注意：加样时应防止加样器头碰坏凝胶孔壁）。5电泳：靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳，控制电压在80-100V左右 。当染料条带移动到距离

13、凝胶前沿1cm时，停止电泳。6染色：将电泳后的胶板小心推进含溴化乙锭（0.5g/mL）的染色液中，室温下浸泡约30min。7观察：小心取出凝胶并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，将凝胶放在紫外灯观察台上，在波长254nm紫外灯下进行观察。8结果分析：在DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带。质粒DNA由于不同构型的DNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率不同，因此在琼脂糖凝胶电泳可出现三条电泳带，分别为三种构型的质粒DNA，超螺旋DNA最快, 线状DNA次之,开环DNA最慢。17上样缓冲液（上样缓冲液（6 6）：）： 指示剂（指示剂（溴酚蓝和二甲苯青）一般加在电泳上样缓冲液中，可使样品带色，溴酚蓝和二甲苯青）一般加在电泳上样缓冲液中，可使样品带色，便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。蔗糖：蔗糖：增加样品密度，使样品均匀沉到加样孔底部。增加样品密度，使样品均匀沉到加样孔底部。