RA序贯诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化及对.蛋白表达的影响

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1、郑 州 大 学 20 08 届 硕 t .学位 论 文中文 摘 要R A 序 贯 诱 导 组 之 间 无 显 著 性 差 异 (尸 0 .05) 。W 七stem 七lot 检 测 显 示 : 未 分 化 E S C s 中表 达 4 .IN 和 4 .IB 蛋 白 ，诱 导 分 化 后两 者 表 达 量 都 增 加 。结 论1 . R A 序 贯 诱 导 法 可 在 E S C s分 化 后 第 7 d 获 得 神 经 元 样 细 胞 ，较 4 一/4+ 诱 导 法 提 前3 d ，且 两者 的N S E 和 G F AP 阳性 细 胞 率 无 差 异 ， 因此 R A 序 贯 诱 导 法

2、可 作 为经 典 的4 一/4+ 诱 导 法 的 替 代 方 法 。2 . 4 .IN 和 4 .IB 蛋 白的 表 达 量 随 着 E S C s分 化 为 神 经 细 胞 而 增 加 。关 键 词 : 胚 胎 干 细 胞 ; 分 化 : 维 甲酸 ; 神 经 细 胞 ; 4 .1蛋 白郑 州 人学 200 8 届硕 l 研 究 生 毕 业论 文 英 文 摘 要R A 一tr e a te d S e q u e n tia l Me th o d I n d u e e d E m b ry o n ie S te mC e lls D iffe r e n tia tio n in to

3、 N e u r a l C e lls a n d th e E x P r e s sio n C h a n g e o f P r o te in 4 .1 a fte r th e In d u e tio nP o stg r 时 u a teJ ia n g Y u a n y U a n T u to rX in g Y i n gD e P 良r tm e n t o f P h y sio lo g y， t h e B a sie M e d ic a l C o lle g e o f Z h e n g Z h o u U n iv e r sityZ h e n g

4、 Z h o u ，H e n a n ，4 5 0 0 5 2A b s tr a C tE m b ryo n ie stem cells (E S C s) w h ieh d eri v ed fro m the inn er eell m ass (IC M ) o fb la sto e y s t一sta g e e m b r y o s h a v e th e a b ility to P r o lif er a te in d e f in ite ly in v it roa n d t h eP lu r iP o te n e y to d if fe r en

5、tia te in to a n y e e ll t冲 e d e ri v e d f ro me e to d e rm，m e so d e r m o re n d o d e rm L o t景o f re p o rts in d ic a te d th a t E S C s e o u ld b e d ire e tio n a lly d ifl触re n tiatedin to n e u r al e e lls in sP e e if ie in d u e e d sy ste m w h ie h P ro v id e d P ra e tie a l e

6、 v id e n e e s f or t h e tra n sP la n ta tio n o f E S C s to t re a t e e n te r n e rv o u s sy ste md ise a se s . S o f ar ，th e m e th o d su se d to d ire c tio n a lly in d u e e E S C s d if fe re n tia tio n in to n e u ra l e e lls in e lu d e 4 一/4 + a s s a y ，fiv e一steP m eth o d ， S

7、 D IA (a strom al cell一d eriv ed in d u ein g aetiv ity )， ad h eren t m o n o c u lt ur e ，g e n e m e th o d s ，a n d 50 o n . 4 一/4 + a ss a y 15 th e m o st c la ssie a l m e t h o d . H o w ev er，E S C s m u st form em b 理o n ie b o d ies (E B ) b efore in d u eted b y R A w hiehm a k e s it d

8、if fi e u lt to c o n tr o l a n d a n a ly Z e t he P r o e e s s o f in d u e tio n . M o r eo v e r t his m e th o d re q u ire s lo n g c u lt ure tim e ， c o m P lie a te d m a n iP u la tio n a n d str ic t e u lt Ure e o n d itio n in e lu d in g e e ll d e n sity ， n u tr itio n a n d e q u

9、iP m e n ts . S e a rc h in g f o r a n e win d u etio n m eth o d to sh o rten the in du etio n P eri o d an d sim P lify m an iP ulatio n w illim P r o v e t h e st ud y o n E S C s e u lt ure a n d d if l笼re n tia tio n in v it ro . It 15 u n e e rt a in a b o u t th e m e c h a n ismo f E S C s

10、d if l七re n tia tio n in to n e ur a l c e lls P re s e n tly . M a n y re se a r e h e r sfou n d that th e ex P ressio n o f so m e P rotein in ereased (i.e . P K C 6 an d P K C 。) o rd ecre ased (i，e . n o tch l) d uri n g n eur al eells d ifl七ren tiatio n . S tud y ab o u t rat P C 12 e elld if

11、fe r en tia tio na n dm o u s ee e re b e llu mn e u ro nd e v e lo P m e n t re v e a le dth a tt h eIV丫郑 州 大学 20 08 届 硕 !:研 究 生 毕业 论 文 英 文摘 要exPression am oun t，altem ative sPlieing and locat ion of Pro tein 4 .1 changed aiong w iththe d iffe ren tiatio n o f n eu ral e e lls . B ut it，5 un e le a

12、r ab o u t the e x P ressio n ch an g e o f 4 .1P r o te in in t he P ro e e ss o f d if fe re n tia tio n E S C s in io n e u r al e e lls.o bjeetive1 . T o d e v e lo P a n e w m e th o d to in d u e e E S C s d if fe re n tia te in to n e u ra 】e e lls in v itro ，thereb y sh orten diffe rentiated

13、 tim e an d sim P lify m an iPu lation 2 T O st ud y t he e x P r essio n o f P ro te in 4 .lN a n d 4 .lB d u ri n g d if fe re n tia tio n o f E S C sin to n e u r a l e e lls in v itro . M e t h o d SE S C s w e re o f fe re d b y Z h e n g Z h o u U n iv e r sity ste m e e lls la b o ra to r y.

14、A f te r a n a b io sis，E S C s w e re se e d e d o n a m ito n y c in C 一别汀e ste d M E F m o n o la y e r a n d e u lt Ur e dw it h t h e M E F c o n d itio n e d m e d iu m c o n i a in in g L IF .A s E S C s g r o w t h sta b ly ， r eP la n t th e mo n e u lt ure P la s tie d ish e s a t a d e n

15、s ity(10 5/m l). 下比ee 脚 叩 5 w ere set as 伪llo w s: (l) e o ntro l 脚 即 : E s C s w ere seed ed in E B eu lh 甘e m ed ium an d eu ltured w ith o u t an ad d itio n al revu lsan t. (2 ) 4 一/4+ in d u eedg o u P : E S C s w e re su sP e n d e d in E B e u lt ur e m e d iu m f or 4 d to f or m E B ，d 丽 n

16、g w h ie h sh o o k e v 恻 2 一3 h to a v o id E B a d h e s io n . o n s t h d 出 e e e lls w e re e o lle e t司 a n d s喇 e d o n glu tin一co ated eu lture p lastie d ish es in .in d uetio n m ed ium (co n tain in g 10七 m o l/LR A ). E x ch an g e w ith E B eu ltur e m ed ium after 4 d . (3 ) R A 一treat

17、ed seq u en tial in d u eed脚 即 : E s C s w ere seed ed in in d u etio n m “ ium (eo n tain in g 10 一6 m o l/L 队 ) d irec t一y A fter 4 8 h ，ev ery d ish w as ad d ed 3 m l n eu ra】stem eells cu lture m ed ium (co n tain in g 20 林g/L b F G F，2 % B 2 7，l % N Z ，D M E N f F 12 w ith o u t F B S ).A fter

18、 Z d ，ev ery d ish w as ad d ed 1 m l n eu ra】eell eu lture m ed ium (co n tainin g Z % B 2 7 ，15 % F B S ，D M E M 用 12 )e v 卿 d a 丫 o n 7 th d th e m 比 iu m w a s e x c h a n g e w ith n e ura l e e ll e u 一t ur e m 比 iu m .In v e rt e d m ic ro sc o P e w a s u s e d to o b s e rv e t h e s h a P

19、e o f E S C s d u r in g d ifl笼re n tiatio n . Irnrn un o e yto ch em ie a l stainin g w a s aP P lied to c alc u late the po sitiv e p erC 即 ta罗 o f N s E an d G FA p p o sitiv e e ells resp eetive l丫 We stem 一b lo t w as us ed tost u d y th e 4 .1 N a n d 4 .I B e x P r es sio n a m o u n t.R e S

20、川 tsU n d e rin v e rt e dm ic ro sc o P e ， M E Fw a sf u s if or ma n da d h er e n t.T h e郑 州 大 学 20 08 届 硕 卜研 究 生 毕业 论 文 英 文摘 要u nd iffe ren tiated E S C s grew in eolonies w ith high refraetion .A fter d iffe rent iation for1 0 d ，t h e e e lls in e o n t ro l g r o u P w e re a lm o st e P it

21、he lia l一lik e e e lls，s议汀o u n d e d b y a f ew 允 51伪 r m e e lls . In 4 一件 + in d u e 记 脚 u P ，a n e r 1 2 h a d h e sio n o n s th d ，so m e 几 5 1伪 r me e l一5 m ig a te d 加 m u n d i衡 e n tia t记 E s e s e o lo n ie s ; o n l o t h d ，n e u r a l一lik e e e lls w e re o b se rv e d w ith sle n d e

22、r P ro e e sse s to f or m n e tw o r k . I n R A 一t re a te d se q u e n tia l in d u e e d o 即 ，n e u ra l一lik e e e lls w i止 sle n d e r p r o c e sse s w e re o b se r v e d o n s t h d . s 曲 s叫 u e n tl% th e n u m b e r o f n e u ra l一lik e e e 一15 in e re a se d o b v io u sl丫 o n 7 th d th e

23、 e e lls d isp la y e d 小 in lo n g b iP o la r o r m u ltiP o la r P r o e e ss e s to f o r m n e t w o r k .A f te r d if fe re nt ia tio n f o r 1 0 d ，N S E P o sitiv e e e ll r a te s o f e o n t ro l g r o u P ，4 一/ 4 + in d u e e d g r o u P a n d R A 一t re a te d s e q u e n tia l in d u e

24、e d g r o u P w e re 1 1 .8 % 士 1 .8 % ，5 0 .6 % 士 2 .7 %a n d 5 7 .6 % 土 1 .4 % . G F A P P o sitiv e e e ll r at e s w e re 1 9 .0 % 土 2 .9 % ，3 6 .0 % 士2 .5 % a n d 3 3 .0 % 士 2 .0 % ，se P a ra te ly . S ta tistie s a n a ly sis sh o w e d t h a t t h e re a reP rom in en t d iffe ren ee b etw ee

25、n eo n trol an d either in d u etion gro u P (P 0 .0 5).W 七ste m 一b lo t sh o w e d t ha t 4 .I Na n d 4 .I Bw e ree x P re sse d in u n d if f改e n tia te dE S C s a n d b o t h th e rn in e re a se d a f te r in d u e tio n . C o n c lu s io n s1 . R t re a te d s e q u e n tia l in d u e e d m e 仇

26、 o d e a n g e t n e u r o n 一lik e e e lls o n 7 t h d ，3 d b e f o r e 4 一/ 4 + a s sa y . N S E a n d G F A P P o sitiv e e e ll P e re e n ta g e s h a v e n o d if fe re n e e b e tw e e n th e tw o g r o u P s . 5 0 R A 一t re a te d se q u e n tia l in d u e e d m e th o d e a n b e u se d tor

27、e P la e e e la s sie a l 4 / 4+ a s sa y .2 . T h e le v e l o f 4 .IN a n d 4 .I B in E S C s in e re a s e s d 丽 n g d if l笼re n tia tio n in t o n e ur a l e e lls .K e y w o r d s : E m b r y o n ie ste rn e e lls ; d if l七re n iia ti o n : re tin o ie a e id : n e ur a l e e lls : P r o te in4

28、 .1士目录正 文R A 序 贯 诱 导 小 鼠胚 胎 干 细 胞 向神 经 细 胞 分 化 及 对 4 .1 蛋 白表 达 的 影 响 l前言 . 1材料 与方法 .2讨论 . 17结论 .，.，.26参 考 文 献 .27综 述胚 胎 干 细 胞 体 外 分 化 的 研 究 进 展 .，.32 参 考 文 献 .，.44附 录中 英 文 缩 略 词 表 .51致谢 .52郑 州 大 学 200 8 届 硕 七学位 论 文R A 序 贯 诱 导小 鼠胚 胎十细 胞 向神经 细胞 分化及对 4. 1 蛋 白表 达 的影 响RA 序 贯 诱 导 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 向 神 经 细 胞 分

29、 化及 对 4 . 1 蛋 白表 达 的影 响研 究 生姜 媛 媛导师邢莹教 授郑 州 大 学 基 础 医 学 院 生 理 学 教 研 室河 南郑 州4 500 52前性旨口胚 胎 干 细 胞 (。刀b ryo nic stem eells ，E s C s) 是 从 早 期 囊 胚 的 内细 胞 团 (inn erceU m ass，IC M ) 分 离 出来 的 一 种 多 能 细 胞 系 ; 它 能 在 体 外 长 期 不 断 自我 更 新 ，并 保 持 多 向分 化 潜 能 ，可 以分 化 为 内 、中 、外 三 胚 层 来 源 的 几 乎 所 有 类 型 的 细 胞 。198 1年

30、，E v an s和 M art in，2，分 别 从 小 鼠囊 胚 的 内细 胞 团 和 生 殖 蜡 成 功 地 获 得 多 潜 能 干 细 胞 。 1998 年 ，美 国Wi sco nsin大 学 Th om son 等 l3成 功 地 从 人 囊 胚 的 内细 胞 团 中 分 离 出 了人 类 第 一 株 E S C s给 医 学 界 带 来 前 所 未 有 的 冲 击 ，E S C s成 为 生 命 科 学 的研 究 热 点 。 己有 研 究 表 明 ，E S C s在 特 定 的诱 导 培 养 体 系 中 ，可 被 定 向诱 导 分 化 为 神 经 细 胞 ，为 E S C s的

31、移 植 治 疗 神 经 系 统 疾 病 提 供 了实 践 依 据 。迄 今 为 止 ， 体 外 诱 导 法 主 要 有 4 一/4+ 法 t4、 五 步 法 5、基 质 细 胞 诱 导 法 6、单 层 粘 附 培 养 法 7 和 基 因 修 饰 法 l8等 。 其 中 ，4 一/4十法 是 最 经 典 的 诱 导 法 ， 但 该 方 法 使 用 维 甲 酸 (retino i。cid ，队 ) 诱 导 前 需 形 成 类 胚 体 (emtr卿 n i。b od ies，E s ) ，使 分 化 较难 控 制 和 分 析 ，且 培 养 时 间 长 、操 作 复 杂 ，对 细 胞 密 度 、营 养

32、 和 设 备 等 培 养 要 求 较 高 。 探 索 新 的 细 胞 诱 导 方 法 用 以减 少 诱 导 时 间 、 简 化 操 作 将 促 进 E S C s体 外 培 养 分 化 的 研 究 。 目 前对 E S C s分 化 为 神 经 细 胞 的 机 制 仍 不 清 。 有 报 道 称 ， 在 E S C s 向神经细胞分化过程 中出现某些蛋 白的表达增高 (如PK C 6和PK c 尸) 或者降低 (如 n otch l0) 。4 .1蛋 白【，2是 一 种 细 胞 骨 架 蛋 白 ，对 维 持 细 胞 形 态 具 有 重 要 作 用 。 在 对 大 鼠嗜 铬 神 经 瘤 P C

33、12 细 胞 分 化 和 小 鼠 小 脑 神 经 元 发 育 的研 究 中 均 发 现 细 胞 骨 架 蛋 白4 .1蛋 白 的 表 达 量 、剪 切 形 式 和 细 胞 定 位 会 随 着 神 经 细 胞 的 分 化 而 改 变 3一161。 但 4 .1蛋 白在 E s c s向 神 经 细 胞 分 化 过 程 中 的 改 变 尚有 待 研 究 。夕郑 州 大学 20佣 届硕 士学位 论 文R 序贯 诱 导小 眼胚胎干细胞 向神经 细胞分化及对 4. 1 蛋白表达 的影 响材料与方法1. 实验 材 料L l 实验 动 物 :昆明 小 鼠 由郑 州 大 学 实 验 动 物 中心 提 供 ，用

34、 于 获 取 滋 养 层 细 胞 。小 鼠胚 胎 干细 胞 系 由郑 州 大 学 医学 院干 细 胞 中心 建立 并保 存 。1.2 主 要 实 脸 试 剂高糖 D M E M 培 养 基 美 国Gi b co 公 司胎 牛 血 清 (F B S ) 杭 州 四季 青 生物 公 司维 甲酸 (RA ) 美 国sigm a公 司 p一琉 基 乙醉 (p一 erc aPtoeth ano D 美 国成gln a公 司 丙 酮 酸 钠 美 国aigm a公 司非 必 需氨 基 酸 (N E A A ) 美 国访访如 gen 公 司丝 裂 霉 素 C (M M C ) 浙 江 海 正 制 药 厂胰 蛋

35、 白酶 美 国A m 找活co 公 司乙二 胺 四 乙酸 (E D 下A ) 美 国A mi 铭 co 公 司多聚 赖 氨 酸 (P ol梦L- 幼 sine ) 北 京 中杉 生 物 公 司D M E M 压12 培 养 基 美 国G IB C O 公 司B 2 7 美 国G IB C O 公 司N2 美 国G IB C O 公 司碱 性 成 纤 维 生 长 因 子 (b F G F) 美 国sigm a公 司青/链 霉 素 浙 江 海 正制 药 厂特异性烯醇化酶伽 sE) 多克隆抗 体 北京 中杉生物 公司 胶 质 纤 维 酸 性 蛋 白(G 刊J )多 克 隆 抗 体 北 京 中 杉 生

36、 物 公 司 巢 蛋 白 (n estin ) 单 克 隆 抗 体 北 京 中 杉 生 物 公 司4.IN 、4.IB 多 克 隆 抗 体 美 国 纽 约 血 液 中心 安 秀 丽 博 士 惠 赠R ab b itS P 试 剂 盒 北 京 中 杉 生 物 公 司卜朗血 单 克 隆 抗 体 北 京 博 奥 森 生 物 公 司D A B 显 色 试 剂 盒 北 京 中 杉 生 物 公 司郑 州大学 2021 届硕 十学位 论文RA 序 贯诱导小 鼠胚胎 干细胞 向神经细胞 分化及对 4. 1 蛋 白表达 的影响1.3 主 要 仪 器医用 净 化 工 作 台苏 州 高 新 净 化 工 程 有 限

37、公 司低 速 离 心 机T D 卜4OB ，上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂高速 离 心 机T G L 一16G ，上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂恒 温 箱K 一SD 型 ，上 海 森 信 实验 仪 器 有 限 公 司干 燥 箱10 1一3一B S .n ，上 海 跃 进 医疗 器 械 厂倒 置 显 微 镜 ( 图像 采 集 系 统 )IX 一71 ，JaP an ol 丫m p u s普 通 显 微 镜C X 一21 ，J即 an ol ，m pusC 0 2培 养 箱IG O 一150 ，F ran ee Jou an高 压 自动 消 毒 柜H v E 一50 ，JaP an Hi

38、rayam a电子 分 析 天 平B S 124 S ，北 京 赛 多 利 斯 仪 器 系 统 有 限 公 司自动 双 重 纯 水 蒸 馏 器5 2 一93 ， 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂紫 外 线 分 光 光 度 仪U 2 001 型 ，JaP an H ITA C H I电热 恒 温 水 槽D K 一SD 型 ，上 海 森 信 实验 仪 器 有 限 公 司电泳 仪D Y Y- llB 型 三 恒 电泳 仪 ，北 京 六 一 仪 器 厂1.4 主 要 试 剂 的配 制一4 .1普 通 P B S : N aC I 8.0 9 ，K C I 0 .2 9 ，N 处H P O 412H

39、20 3 .4 7 9 ，K H ZP O4 0 .2 9加 三 蒸 水 至 100 0 m l ， 充 分 溶 解 后 ， 调 整 pH 值 至 7.2 ，过 滤 后 分 装 入 2 50 m l 盐 水 瓶 中 ， 室 温 保 存 。使 用 前 高 压 12 1 ，21 m in 蒸 汽 消 毒 。1.4 .20 .0 1 M P B s : N aH ZP O4 2H 20 3 1.2 9 ，N 处H P o 412 H Zo 7 1，6 3 9 ，溶 解 于 1000m l 三 蒸 水 中 ，制 成 0 .2 M的 母 液 。取 0 .2 M N aH ZP O 4溶 液 9 .5 m

40、 l，0 .2 M N 处H P O 4 溶 液 4 0 .5 m l ， 混 合 后 加 入 N aC I 8.5 9 ， 加 三 蒸 水 至 1000 m l ， 充 分 溶 解 ， 调 整 p H值 至 7.4 ， 分 装 备 用 。1.4 .3n M E M 培 养 基 : 将 高 糖 D M E M13 .5 9 ，N 水 c o 3 3 .74 9 和 H E p E s 2 .g g 充分 溶 解 于 100 0 m l 消 毒 三 蒸 水 中 ，用 1 N N ao H 或 1 N H e l 调 pH 值 至 7 .1 ，0 .2 2林m 滤 膜 过 滤 灭 菌 ， 分 装

41、到 至 10 0 m l 消 毒 盐 水 瓶 ， 封 好 ，一20 冻 存 。1.4 .4D M E M /F 12 培 养 液 : D M E M /F 12 12 .0 9 ，N aH C o 3 3 .74 9 ，充 分 溶 解 于 10 0 0m l 消 毒 三 蒸 水 中 ，用 1 N N ao H 或 1 N H C I 调 p H 值 至 7 .1 ，0 .22 娜 微 孔 滤 膜 过滤 灭 菌 ， 分 装 至 10 0 m l 消 毒 盐 水 瓶 ， 封 好 ， 一20 冻 存 。郑 州 人学 20 08 届硕 _!:学位 论 文R A 序 贯 诱 份小 限胚 胎 十细 胞 向

42、神经 细 胞分 化 及对 4. 1 蛋 白表达 的彬 响1.4.5细 胞 消化 液 : 0.25 %胰 蛋 白酶/0. 02 % E D TA : 称 取 0.25 9 胰 蛋 白酶 置 于 烧 杯 中 ，先参加 少量 P B S 调成糊状后 ，再添加 P B S 至 100 而 混 匀 ，4 过夜 ， 次 日称 取 0.02 9 E D TA 于 胰 蛋 白酶 溶 液 中 ，充 分 溶 解 后 用 N aH C 0 3调 p H 值 为 7 .2 ， 0.22 户m 滤膜过滤除菌 ，一20 保存 。1.4.6丝 裂 霉 素 c 工 作 液 : 将 2 m g 丝 裂 霉 素 c 溶 解 于

43、5 m l 消 毒 三 蒸 水 中 ，配制 成 0 .4 m 创m l 的母 液 ，于 4 避 光 保 存 。使 用 前 ，用 M E F 培 养 基 稀 释 40 倍 配 成 终 浓 度 为 ro 林创m l 的工 作 液 ， 即 5 m l 培 养 基 加 125 川 母 液 。工 作 液 于 4 避 光 保 存 ，Z w 内使 用 。1.4.70.5 % 明胶 溶 液 : 称 取 明 胶 5.0 9 ，加 三 蒸 水 1000 m l，65 30 m in 水 浴 ， 使 明胶 溶 解 ，迅 速 用 0.22 林m 滤 膜 过 滤 消 毒 (温 度 下 降 后 难 以过 滤 ) 后 ，于

44、 4 保 存 备 用 。 明胶 预 先 包 被 培 养 瓶 (皿 ) 的 处 理 方 法 : 将 0.5 % 明胶 水 溶 液 加 入 培 养 瓶 (皿 ) 内 ，能 覆 盖 培 养 瓶 (皿 ) 底 部 表 面 即可 ，在 室温 下 或 培 养 箱 内静 置 1 h 以上 。使 用 前 ， 吸 弃 明胶 溶 液 ，P B S 洗 涤 1 次 。1.4.8双 抗 溶 液 : 取 消 毒 三 蒸 水 160 m l，加 入 青 霉 素 钠 160 万 u 1.0 9 ，混 匀 ，弃 去 60 m l，再 加 入 链 霉 素 100 万 u 1.0 9 ，混 匀 后 过 滤 分 装 ，20 冻 存

45、 ，备 用 。 1.4.94 % 多 聚 甲醛 : 三 蒸 水 50 m l，加 多 聚 甲醛 4 .0 9 ， 加 热 至 4 0 一50 ，溶 解 后 加 0 .0 1 M P B s 至 100 m l， 调 p H 至 7 .4 一7:6 ，过 滤 后 4 .c 保 存 备 用 。1.4 .10 各 种 培 养 液 组 分1.4 .10 .1M E F 培 养 基 : 高糖 D M E M 、 10 % F B S 、 1 %双 抗 。1.4 .10 .2E s e s 培 养 基 : 条 件 化 培 养 基 (e M )、s % F B s 、0 .1 mm o 比 p 一琉 基 乙

46、醉 、 1 %非 必 需 氨 基 酸 、 1 %丙 酮 酸 钠 。1.4 .10 .3E B 培 养 基 : 高 糖 D M E M 、2 0 % F B S 、 l %双 抗 、0 .1 mm o F L p 一疏 基 乙 醉 、 1 %非 必 需 氨 基 酸 、 1 %丙 酮 酸 钠 。1.4 .10.4诱 导 培 养 基 : E B 培 养 基 加 入 10 石m o F L R A 。1.4 .10 .5神 经 细 胞 培 养 基 : D M E M 下 12 、 15 % F B S 、2 % B 2 7 。1.4 .10 .6神 经 干 细 胞 培 养 基 : n M E N F

47、12 、2 % B 2 7 、 1 0，0 N Z 、2 0 林岁L b F o F 。1.4 .11认lestem 一blot 相 关 溶 液1.4 .11.1 40 % A rc汤is 贮 液 : 丙 烯 酞 胺 20 .0 9 ，N ，N 亚 甲 双 丙 烯 酞 胺 0.54 9 ，三 蒸 水 2 0 m l， 混 匀 搅 拌 ，溶 液 澄 清 透 明 后 ， 再 用 三 蒸 水 稀 释 至 50 m l，过 滤 后 4 避 光 保 存 ， l m 内 使 用 。1.4 .11.2浓 缩 胶 缓 冲 液 (o .x56 M Tri s一H c L ，p H 6 .8 ): Tri s l

48、.8 8 3 g ，s D s o .12 5 g ，郑 州 大 学 200 8 届 硕 十 学位 论 文R A 序 贯 诱 导 小 鼠胚 胎 + 细 胞 向神 经 细 胞 分 化 及 对 4 . 1 蛋 白表 达 的 影 响双 蒸 水 50 m l，用 浓 盐 酸 调 节 p H 值 至 6 .8 ，再 用 三 蒸 水 定 容 至 loo m l，4 保 存 。 1.4 .11.3分 离 胶 缓 冲 液 (0 .75 M Tri s一H C L ，p H S .8 ): Tri s g .o6 g ，s D S o .l g ，双 蒸 水 50 m l，用 浓 盐 酸 调 节 p H 值 到

49、 8.8 ，再 用 三 蒸 水 定 容 至 10 0 m l ，4 保 存 。1.4 .11.44 x 样 品 缓 冲 液 :Tri s o .96 g ，甘 油 16 m l，s D s 3 .2 g ，加 入 三 蒸 水 至 4 0 m l，4 保 存 ， 临 用 前加 入 p一琉 基 乙醇 ，终 浓 度 为 10 %。1.4 .11 .510 % 过 硫 酸 钱 (A P) : AP o .l g ，三 蒸 水 l m l， 混 匀 ， 充 分 溶 解 ， 用 前 配 制 。1.4 .11.6s x 电泳 液 : Tri s 15.1 9 ，甘 氨 酸 94 .0 9 ，s D s 1.

50、0 9 ，加 三 蒸 水 稀 释 到 2 50 m l ，p H 滴 定 至 8.3 ，4 保 存 ， 用 前 稀 释 5 倍 。1.4 .11 .7丽 春 红 染 色 液 : 丽 春 红 1.0 9 ，三 氯 乙酸 15 .0 9 ，磺 基 水 杨 酸 15 .0 9 加三 蒸 水 稀 释 至 50 m l，用 时 稀 释 10 倍 。一4 一1.8转 膜 缓 冲 液 : 甘 氨 酸 2 .9 9 ，Tri s 5.8 9 ，s D s 0 .3 7 9 ，20 %甲醇 ， 加 三 蒸 水 800 m l， 调 节 p H 为 8 .38 .4 ，然 后 定 容 至 1000 m l。1.4

51、 .11.9T B s : Tri s 1.2 1 9 ，N ae l 4 .o g ，稀 释 至 soo m l，浓 盐 酸 滴 定 p H 至 7 .6 ，然 后 用 三 蒸 水 定 容 至 1000 m l。1.4 .11 .10 封 闭缓 冲 液 : 脱 脂 奶 粉 1.0 9 加 入 20 m 1T B S 中 ，微 波 炉 加 热 ，使 完 全溶 解 。1.4 .11 .11 考 马 斯 亮 蓝 染 色 液 : R 一2 50 0.25 9 ， 甲醇 50 m l，冰 乙酸 10 而 ，三 蒸 水4 0 m l 。1.4 .11.12 脱 色 液 : 甲醇 4 5 m l，冰 乙

52、酸 10 m l，三 蒸 水 4 5 m l。1.4 .11 .13 分 离 胶 及 基 层 胶 配 制 :10 % S D S .P A G E 配 置分 离 胶 印H = 8.8) 基 层 胶 (PH = 6 .8)4 0 % A re / b 15Z m l0 .5 m ld d H ZOZ m l0 .5 m lT ri S4 m l4 m l1 0 % A P3 0 闪2 0 林l介 m e d8 林l4 林l2 . 实 验 方 法郑 州 大学 200 8 届 硕 _卜学位 论 文 R A 序 贯 诱 泞小 鼠胚 胎 + 细 胞 向神经 细 胞 分 化及 对 4. 1 蛋 自表达 的

53、影 响2.1 小 鼠胚 胎 成 纤 维 细 胞 (M E F ) 制 备及 丝 裂 霉 素 C (M M C ) 处 理2 .1.1 取 妊 娠 14 d 左 右 昆明小 鼠，颈 椎 脱 臼处死 ，紫 外线灯 照射 下 ，75 % 酒 精 浸 泡 20 m in，无 菌 操 作 下 打 开 腹 腔 ，取 出子 宫 ， 分 离 各 个 胚 胎 组 织 ，放 入 已加 20 而 P B S 的 平 皿 中 ，撕 去 胎 膜 ，去 除 头 部 、 内脏 和 四肢 。P B S 漂 洗 3 次 ，转 入50 mi 三角烧杯中，用弯剪剪成 1 ，左右的组织块。用吸管吸取组织块，均匀摆 放 至 培 养 面 积 为 100 cln Z细 胞 培 养瓶 中 ，每块 间距 S lnln左 右 。组 织 块 放 置好 后 加 入 1 m l M E F 培 养 基 ，可 保 持 组 织 湿 润 即 可 ，在 5 % C O : 培 养 箱 中 37 培 养 ， 24 h 后 补 加 少 许 培 养 基 ; 第 4 d 换 液 ，加 入 3一4 m l 培 养 基 ; 第 7一s d M E F 生 长 达90 % 融 合 时进 行 消