产漆酶菌株的筛选与酶活性的测定论文

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1、产漆酶菌株的筛选与酶活性的测定目 录摘要IAbstractII前言11 材料与方法21.1 实验材料与方法21.2 培养基31.3 实验方法31.3.1 产漆酶菌株的筛选31.3.2 漆酶液态发酵及其制备32 漆酶酶活性的测定42.1 ABTS-分光光度计法42.2 分光光度法具体步骤42.3 酶活性的计算43 菌株的活化43.1 培养基及主要试剂的配置43.2 菌种活化步骤54 改良CTAB法提取待测菌株全基因组54.1 基因组提取55 结果与分析66 讨论和小结91. 讨论92. 小结9参考文献10致谢11摘要 本实验从南昌农药厂土壤中分离筛选出一株能够产漆酶活性的细菌菌株，并初步分析和鉴

2、定了该菌株。此菌株具有生长快速、遗传稳定、菌落规则的特性。为了从土壤中筛选产漆酶酶活相对较高的菌株，采用以愈创木酚为底物，利用平板筛选法和定性测定酶活力法筛选得到高产漆酶菌株。以ABTS2,2-连氮基-双（ 3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸）为底物测定漆酶活得到产漆酶活性的菌株，菌株的产酶高峰期出现在发酵培养基培养后的第6天，最高的产漆酶活为5.33U。通过测序和序列比对得到此菌株为溶血葡萄球菌 JCSC1435（hemolytic Staphylococcus JCSC1435）。适宜的发酵培养基为： 葡萄糖2%，酒石酸铵1%，磷酸二氢钾 0.2%，七水硫酸镁0.05%，无水氯化钙0.0075%

3、，五水硫酸铜0.001%。适宜的培养条件：50ml/250ml发酵培养基，培养温度为28，转速为200r/min，培养时间为7d。关键词：漆酶、愈创木酚、溶血葡萄球菌 JCSC1435Abstract The collected soil from the pesticide factory in Nanchang as material, and in 2014 July to September, to isolate a bacterial strain, rapid growth, genetic stability, with the activity of laccase, and

4、 the physiological and biochemical properties of the strain were studied. In order to select the laccase enzyme activity is relatively high strain, by using guaiacol as substrate, using plate screening method and qualitative determination of enzyme activity of laccase producing strain was selected.

5、Screening of a strain of laccase producing strains with high activity from the soil, the sixth day peak of enzyme production strains in culture medium after inoculation with 2,2, ABTS - (even the amino - (3- ethyl phenyl thiazole -6- sulfonic acid) as substrate by determination of laccase activity o

6、f laccase producing strains, the highest the laccase activity was 5.33U. Through sequencing and sequence alignment by this strain ,the bacteria is Staphylococcus haemolyticus JCSC1435.The suitable culture medium for fermentation of glucose 2%, ammonium tartrate 1%, potassium dihydrogen phosphate 0.2

7、%, magnesium sulfate seven, water 0.05%, anhydrous calcium chloride 0.0075%, five copper sulfate 0.001%. The suitable culture condition: 50ml/250ml culture medium, culture temperature was 28 C, the speed of 200r/min, the culture time was 7d.Key words：Laccase, guaiacol, Staphylococcus haemolyticus JC

8、SC1435I前言漆酶是一种结合多个铜离子的多酚氧化酶，其肽链一般由500个左右氨基酸组成，糖配基占整个分子的10%-45%，是一种结合多个铜离子的糖蛋白，是铜蓝氧化酶蛋白家族的一员漆酶是一种绿色的生物催化剂 12-15。漆酶广泛存在于自然界的许多物种中，包括动物、植物、微生物和细菌。漆酶，具有广泛的底物。它不仅能催化氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素，去除许多有毒酚类物质的毒性，还可以使多种染料及其废水脱色。因此在食品、造纸、环保、生物检测、医药卫生等领域具有较大的研究和应用价值1,2。其作用主要表现在：参与有机物合成、生物检测、纸浆生物漂白、工业废水处理、有毒化合物的清除等。由于漆酶很大

9、的应用价值，进行产漆酶菌的分离筛选也一直是研究的热点之一。从目前的报道显示，漆酶最主要来源于子囊菌、担子菌亚门的高等真菌，尤其是担子菌的白腐真菌3，目前报道来看这些菌株是最有效的芳香族类化合物的降解菌。但是白腐菌一般生长周期长，其所产漆酶大多是诱导酶4，这些特征使工业生产漆酶难以有效进行，因此筛选生长周期短、产漆酶时间早的菌株具有非常重要的意义。通过大量的实验研究，目前已经获得了许多产漆酶的细菌和霉菌，比如膨大拟青霉菌5，就具有一定降解木质素能力。有关枯草杆菌与球菌分泌漆酶也有少量报道，但是它们漆酶活性都比较低。目前有关漆酶的最普遍的来源是真菌，已知在许多种真菌菌株的分泌物中检测到了漆酶的活性

10、6。本实验是从土壤中筛选能够产生漆酶的菌株，选用简便有效地筛选方法，更快的筛选具有产漆酶能力的高产菌株。从有关漆酶的报道来看，我们可以知道对产漆酶菌株的研究是非常有意义的，因此我选择了这个课题实验。我们从南昌农药厂采集不同的土壤进行研究，从土壤中筛选出能够产漆酶的菌株，并对高产漆酶的菌株进行鉴定。1 材料与方法1.1 实验材料与方法 根据土样采集标准方法7，本实验以从南昌农药厂采集来的土壤样品各5g为材料，在无菌操作下，通过初筛和复筛，挑取筛选平板上菌落规则、颜色明显并具漆酶酶活性质的单菌落，用ABTS分光光度计法在420nm的波长下漆酶酶活，选出产漆酶最高的菌株。将此菌株用20%的甘油保藏备

11、用。之后将此产漆酶酶最高的菌株进行活化后并用CTAB法提取待测菌株全基因组做菌种鉴定。 实验设备及主要试剂：LDZX50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂PHS-3C型雷磁PH计 上海精密科学仪器有限公司LRH-250A型生化培养箱 韶关市泰宏医疗器械有限公司SWCJ2G型双人净化工作台 苏州净化设备有限公司UU765型紫外可见分光光度计: 上海精密科学仪器有限公司 JW3022HR型高速冷冻离心机 安徽嘉文仪器装备有限公司1012型干燥箱 上海市实验仪器总厂SPY50型双层培养摇床 上海市离心机械研究所愈创木酚：2-甲氧基酚ABTS：2,2-连氮基-双（ 3-乙基苯丙噻唑啉-6-

12、磺酸）HAC-NaAc(pH4.5)缓冲液TE缓冲液：称Tris-cl 15.764g，EDTA 0.2922g，加蒸馏水调pH至8.0， 再定容至1000ml，高温灭菌即可。裂解缓冲液：称Tris-cl 15.764g，EDTA 0.2922g，加蒸馏水调pH至8.0，再加蔗糖119.801g，最后定容至1000ml，高温灭菌即可。CTAB缓冲液：称Tris-cl 15.764g，EDTA 0.2922g，CTAB 20g,NaCl 87.66g,加蒸馏水溶解调pH至8.0，最后定容至1000ml，高温灭菌即可。TBE(5）：称Tris 54g，硼酸27.5g，EDTA 0.29225g，加

13、蒸馏水溶解调pH,8.0后定容至1000ml，即可。3mol/ml的醋酸钠缓冲液：无水醋酸钠24.61g，超纯水100ml，冰乙酸调pH5.2后，4保存备用。1.2 培养基1.2.1 PDA筛选培养基 土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，愈创木酚(或a-萘酚）0.4ml/L，pH自然，120灭菌20min。1.2.2 种子培养基 土豆200g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，120灭菌20min。1.2.3 发酵培养基 葡萄糖20g/L，酒石酸铵10g/L，磷酸二氢钾 2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，无水氯化钙0.075g/L，五水硫酸铜0.01g/L，pH自然，120灭菌2

14、0min。1.2.4 菌种保藏斜面培养基 土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH自然，120灭菌20min。1.3 实验方法1.3.1 产漆酶菌株的筛选1.3.1.1 平板初筛 将从南昌农药厂采取的土壤样品分别称量5g梯度稀释到10-7涂布到PDA筛选培养基进行培养（梯度稀释到10-3 菌株才会再生长）。取1ml土壤稀释液均匀涂布在含有愈创木酚(或a-萘酚）的PDA培养基上，28恒温培养7天，或者直接挑取少量土壤接种于含有愈创木酚(或a-萘酚）的PDA培养基上，28恒温培养7天。待菌株生长出后，挑取周边有红色（紫色）变色圈（菌株分泌的胞外漆酶能使以愈创木酚为底物进行氧化，形成

15、鲜艳、均匀的红色氧化带,并且菌株颜色深浅、带宽能较好地反应漆酶活性）的菌落划线分离。将分离后的能产生变色圈的菌株重新接种至新的平板，对菌株进行了重复筛选，通过划线分离4次筛选出单菌落，根据菌落颜色的深浅和变色圈的大小可以初步筛选出产漆酶活力较高的菌株。1.3.1.2 摇瓶复筛 在超净工作台中无菌操作，进行接种。用接种环从长满菌丝的平板上挑取少量菌丝接入种子培养基（50ml/250ml），28、200r/min摇床恒温培养48h，取菌悬液接入发酵培养基（50ml/250ml），接种量为3ml/瓶，28、200r/min摇床恒温培养7d。1.3.2 漆酶液态发酵及其制备将初步筛选的菌株用接种环从长

16、满菌落的平板中挑取长势较好的单菌落接入种子培养基（50ml/250ml），28、200rpm摇床恒温培养48h，取菌悬液接入液态发酵培养基（50ml/250ml），接种量为3ml/瓶，28、200pm摇床恒温培养7d。在发酵的过程中对其进行漆酶活性的测定，取出其发酵液，4、10000rpm离心3min，留取上清液，即为粗酶液，置于4冰箱中保存备用。2 漆酶酶活性的测定2.1 ABTS-分光光度计法以ABTS为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一8.9。它有如下优点：（1） ABTS易溶于水，在室温下放置6个月仍比较稳定。（2） 在漆酶的作用下，ABTS有色溶液的摩尔吸光系数比较高，说明

17、以其为底物测定的灵敏度也较高。（3） 其反应只有一步，ABTS的阳离子自由基比较稳定，通常在几个小时或者几天内是稳定的，并且它在水溶液中为浅蓝色。（4） 迄今为止，还没有报道称ABTS有诱变作用、致癌作用，或者有强烈的毒性。一般以ABTS作为底物，采用乙酸-乙酸钠缓冲体系、柠檬酸盐-磷酸盐缓冲体系或者Glycine-Hcl缓冲体系。倘若菌株产生过氧化氢，为了保证测定准确性，需要破坏过氧化氢，应加入一定量的过氧化氢酶。因为菌株在生长代谢过程中，自身会产生过氧化氢激发木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶对ABTS的氧化。2.2 分光光度法具体步骤取酶液0.1ml，加入HAc-NaAc（pH4.5）缓冲液

18、2.5ml，混匀，加入ABTS 0.4ml，放置30s，每15s读取一次420nm下的吸光值。共读取6-7个数值。以往实验判断，如果吸光值增长迅速，需要将酶液稀释2-5倍再次测定，直至吸光值数值变化不是太快，且数值均控制在0.2-0.8之间。2.3 酶活性的计算酶活=吸光度变化的斜率4000稀释倍数酶活单位：漆酶活单位定义为1国际单位（1U）等于每分钟氧化1umol底物或生成1umol产物的酶量。3 菌株的活化3.1 培养基及主要试剂的配置（1） MRS培养基（g/L）：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，酵母膏5.0g，无水乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸铵2.0

19、g，吐温-80 1.0ml，硫酸镁带7个结晶水0.50g，硫酸锰带2个结晶水0.25g，至pH7.0；（2） TE缓冲液：称Tris-cl 15.764g，EDTA 0.2922g，加蒸馏水调pH至8.0， 再定容至1000ml，高温灭菌即可。（3）裂解缓冲液：称Tris-cl 15.764g，EDTA 0.2922g，加蒸馏水调pH至8.0，再加蔗糖119.801g，最后定容至1000ml，高温灭菌即可。（4）CTAB缓冲液：称Tris-cl 15.764g，EDTA 0.2922g，CTAB 20g,NaCl 87.66g,加蒸馏水溶解调pH至8.0，最后定容至1000ml，高温灭菌即可。

20、（5）TBE(5）：称Tris 54g，硼酸27.5g，EDTA 0.29225g，加蒸馏水溶解调pH,8.0后定容至1000ml，即可。（6）3mol/ml的醋酸钠缓冲液：无水醋酸钠24.61g，冰乙酸调pH5.2后，超纯水100ml，4保存备用。3.2 菌种活化步骤将产漆酶高的系列1保藏菌种接种于MRS培养基中，2%接种量接种于MRS培养基，30 、200r/min摇床培养一天，活化二次，此活化的菌株再照改良CTAB法提取全基因组。4 改良CTAB法提取待测菌株全基因组10.114.1 基因组提取（1） 用移液枪吸取生长到对数后期的菌悬液至1.5ml离心管中，12000r/min离心3mi

21、n收集菌体，用50的TE缓冲液洗涤菌体4-5次至离心管后上清液澄清。（2） 加入200ul裂解液（含10mg/ml溶菌酶），15U变溶菌素，用移液枪反复吹打，使菌体均匀悬浮，37保温3h，期间每隔30min摇匀一次。（3） 加入400ulCTAB缓冲液，40ul 10mg/ml的蛋白酶K，50保温3h，期间每隔30min摇匀一次。加入100ul 10%SDS，室温10 12000r/min离心10min，定量取上清液。（4） 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），上下颠倒混匀，常温10000r/min离心5min，定量吸取上清液转移至一个新离心管。（5） 重复上述步骤。（6） 加入等

22、体积的氯仿：异戊醇（24:1），上下颠倒混匀，常温10000r/min离心5min，定量吸取上清液转移至一个新离心管。（7） 加入十分之一倍的体积的预冷醋酸钠缓冲液和二倍体积的预冷无水乙醇，4 12000r/min离心5min，沉淀用预冷70%的乙醇洗二次，再用预冷无水乙醇洗一次，干燥后溶于20ul超纯水中。（8） 加入2ul 1mg/ml的RNase，37保温3h，DNA的完整性及浓度用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，最后分装于1.5mlEp管，-40保存备用。 用改良CTAB法提取待测菌株全基因组后，进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外照射下可以看到DNA电泳图谱，检测提取的DNA样品，将提取的DNA

23、用0.1TE 20ul保存备用。 5 结果与分析a.菌株生长情况 菌落为同心圆向外放射状，颜色为白色。菌丝致密、短绒、并且紧贴培养基。菌落在7d之后逐渐变为不透明的干粉状。如图1为在加愈创木酚的PDA培养基平板上的正反面照片。该类菌株分泌的胞外漆酶能够使愈创木酚变为铁红色。经过筛选培养基筛选得到产漆酶的菌株形态如下：图1 菌株在含有愈创木酚的PDA平板上的菌落情况b.菌株发酵情况 在实验过程中需要优化漆酶合成的发酵条件，才能提高发酵液中漆酶的产量，其中影响产酶的主要因素有初始pH值、摇瓶转速、和接种量，碳源、氮源以及温度等。本实验适宜的发酵培养基为： 葡萄糖2%，酒石酸铵1%，磷酸二氢钾 0.

24、2%，七水硫酸镁0.05%，无水氯化钙0.0075%，五水硫酸铜0.001%。适宜的培养条件：50ml/250ml发酵培养基，接种量为3ml，培养温度为28，转速为200r/min，培养时间为7d。图2 菌株在发酵培养基中发酵的生长情况c.发酵产酶曲线 初步筛选出能够产漆酶的菌株后用发酵培养基摇瓶培养，在发酵摇瓶培养的过程中，培养3天后开始检测酶活，经过ABTS-分光光度计法检测得出在3d菌株开始产漆酶并且逐渐增加，菌株产漆酶量达到最高的是在发酵后的第6天。通过实验分析得到菌株产漆酶酶活最高为5.33U。图3 吸光值的变化注：横坐标每间隔反应时间为15s，纵坐标为OD值变化 根据上述酶活计算方

25、法，得出三种酶活分别为：系列1菌株为5.33U，系列2菌株为5.06U，系列3菌株为1.33U。不同的菌株的产漆酶量不同，从中选取产酶量最高的菌株进行菌株鉴定。在测漆酶活的过程中，取吸光值变化范围在0.2-0.8之间的有效数值。在测漆酶活性的过程中需要快速添加试剂，保证ABTS不被氧化，否则会导致测得反应的OD值有误。d.电泳图谱分析图4 琼脂糖凝胶电泳图谱分析用改良CTAB法提取待测菌株全基因组后，进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外照射下可以看到DNA电泳图谱。 e.序列比对结果分析图5 DNA峰形图图6 菌株的系统发育树通过测序公司测序返回数据之后，用DANMAN查看测序碱基，Chromas可以用

26、来查看DNA的峰形图，进行序列比对之后得出该菌株为溶血葡萄球菌JCSC1435（Staphylococcus haemolyticus JCSC1435）。6 讨论和小结1. 讨论 在整个筛菌过程中需要保证无菌操作，避免杂菌的污染。在初筛过程中要求方法简便、快速、高效，所以筛选方法对于提高效率非常重要。本实验根据漆酶能催化其特征性底物，生成一种具有颜色反应的氧化产物这一特性，选择了一种简便且有效地初筛方法，即以漆酶的特性氧化产物-愈创木酚制成PDA筛选平板，进行漆酶高产菌株的筛选。这种筛选方法可以保证生长的菌株所分泌的蛋白不是其它一些酚类氧化酶，而是漆酶。实验结果非常直观，大大缩短了筛选时间和

27、筛选工作量。在初筛的过程中，将土样梯度稀释至10-3 菌株才会再生长，稀释倍数越高无菌株生长，筛选不到所要的菌株，说明土壤中含有的产漆酶菌株很少，筛选困难。 本实验筛选出了产漆酶的菌株，并对其进行了菌株鉴定。在本实验过程中由于某些步骤操作失误，同时增加了繁重的筛选菌株的时间。在采集来的土壤中能够产漆酶的菌株本身就甚少，同时增加了筛选的困难。经过了多次筛选实验，我们成功筛选出了能够产生漆酶的菌株，并且进行了菌株的鉴定，筛选得到一株产漆酶活性较高的菌株。由于本人实验水平的限制，本实验还有诸多不完善的地方，只能初步得出上述结论，如果想要得到更好的结论，需要进一步做实验，这样才能更清楚的了解产漆酶菌株

28、的生化性质。2. 小结 本实验从南昌农药厂土壤中分离筛选出一株能够产漆酶活性的细菌菌株，菌株的产酶高峰期出现在发酵培养基培养后的第6天，最高的产漆酶活为5.33U，并对该进行了鉴定，命名为溶血葡萄球菌 JCSC1435（Staphylococcus haemolyticus JCSC1435）。参考文献1Couto S R,Herrera J L T.Industrial and bioteachnological applications of Laccases:A reviewJ.Bioteachnology Advance,2006,24:500-5132Riva S Laccases:

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32、给我提供的帮助。有了他们的支持、鼓励，我才能充实的度过了四年的学习生活。 本次实验是在导师和李烨青学姐的细心指导下完成的。感谢生工院为我们提供了实验的平台，让我能顺利完成这次的毕业论文。特别感谢徐波老师在本次试验中的细心指导，帮助我完成实验设计、实验操作，解决了我在实验过程中遇到的问题和疑惑。同时感谢李烨青学姐和实验同伴对我的帮助。实验能够顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心。在此感谢徐波老师的指导和帮助，感谢实验室的同伴侯玉林、夏宇、佐明的帮助，在此表示深深的感谢，没有他们的帮助和支持是没有办法顺利完成我的毕业论文的，愿同学之间的友谊永远长存。 最后祝各位老师、同学们身体健康，生活幸福！10