单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

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1、单克隆抗体的制备、纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA

2、的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。A可溶性抗原（蛋白质） 以1mg/ml5mgml的溶液

3、加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml0.6ml，间隔周再同样注射一次，天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml0.4ml，天后，杀死小鼠取脾做融合用。B. 颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以浓度每只皮下注射.ml，每周次，共免疫次，取脾前天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫动物；目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。品系以Balb/c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从

4、Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以812周龄为宜。免疫程序、剂量和方法关系到能否得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠能产生1.01075.0107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后78天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交

5、瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；脾细胞制备(1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或用CO2处死小白鼠。(2) 将小鼠放于70酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。(3) 把脾放入5ml含有2.5FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。(5) 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。(6) 以2.5FCS1640充满离心管，并以400g离心7min10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。(7

6、) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。(8) 重复、步骤。(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80为合格。骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生球蛋白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；生长速度快，繁殖时间短。目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：S194/5XXOB

7、U1；SP20Ag14（简称SP2）；P2X？ Ag8653（简称653）；FO以653最为常用，它是由矿物油4甲基15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15g/ml 8氮鸟嘌呤。取约11076107对数生长期（即培养15h20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min

8、，沉淀以2.5FCS1640液再悬浮并计数。饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同

9、系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。（1）拉颈处死小鼠。（2）70酒精浸泡消毒10min。（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。（4）用注射器将4ml 11.6蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。（5）1 000rmin离心10min。（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些

10、。4、细胞融合； 小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物单克隆抗体。（1）取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于5

11、0毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；（2）弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；（3）将37水浴中保温的50%PEG1.0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；（4）加完PEG后，将细胞悬液放在37水浴中静置90秒钟，立即在24分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37），开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞；（5）再经100转/分离心10分钟。弃去上清液，加25毫升HAT培养液，

12、轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；（6）将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37孵育。CO2含量为5%；（7）每2-3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培养基。5、单克隆抗体检测 用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多，从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的，而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的，所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。如：膜荧光检测法（1）材料：培

13、养液HEM或RPMI1640；荧光试剂：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠免疫球蛋白；50甘油缓冲液：1份甘油加1份体积0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成；荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。（2）操作方法：用培养液洗涤二次细胞，悬浮成2.0107ml；50l细胞悬液加50l培养上清液混合，置430min，用培养液洗涤3次，1 000r/min离心；以50lFITC抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞，水浴30min60min；用冷培养液洗3次细胞，重新悬浮；取一滴细胞悬液滴在玻片上，复盖片，用甘油缓冲液封固，置荧光显微镜下观察。着色细胞也可以在固定后观察，一滴细胞悬液，涂片

14、、风干，用95酒精固定10min，固定后的载玻片用PBS洗涤，盖上盖玻片，进行观察。免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测 以琼脂双扩散试验法进行，此法简单易操作，特异性好。注意必须将培养液浓缩1050倍，否则做双向琼扩不出现沉淀线。其检测方法为：（1）制备各种兔抗小鼠IgG14、 IgM12、IgA12和K、抗血清,也可直接购买。（2）取5ml培养物的上清液缓慢加入0.5ml的饱和硫酸铵溶液，混匀，静置3h，离心沉淀，去上清，沉淀加0.05ml蒸馏水溶解。（3）制成1琼脂糖凝胶板，打孔。中间孔加20l浓缩上清液，周围孔加20l特异性抗血清，以10l正常小鼠血清作对照。也可以采用酶联免疫吸附试验ELIS

15、A、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测。6、克隆化经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要35次克隆才能稳定。克隆化的方

16、法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。有限稀释法1材料（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万4万。（2）HT培养基2操作方法（1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。（2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和10的悬液。（3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。（4）5CO2饱和湿度，37培养。（5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细

17、胞生长的孔。（6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/31/2时，测培养液抗体。（7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传24代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株7、杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌

18、的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的1001 000倍。利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。1材料（1）经高压灭菌的降植烷。（2）Balb/c鼠：58周龄。（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。（4）RPMI1640培养液（5）新生牛血清2操作方法(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后周内种植细胞。(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用FCS1640液洗涤一次，1 000r/min离心10min。(3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用FCS1640液配成1.0107细胞/ml的悬液。(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂

19、交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0107个细胞/ml）。(5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔13天取1次，可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。8、单克隆抗体的提纯1材料(1) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl缓冲液，20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl缓冲液，40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl缓冲液，80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE-纤维素柱2操

20、作方法（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00105转离心30min，去沉淀。（2）在4于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50硫酸铵浓度。（3）此溶液置冰中30min60min，然后5 000r/min离心10min，去上清。（4）将沉淀溶于TrisHCl缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。（5）装入透析袋于TrisHCl缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。（6）离心去沉淀。（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量。1A 280unit=0.8mg蛋白质。一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg36mg。（8

21、）过DEAE纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。样品进入柱床速度为1ml2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L 150 mMol/L NaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。9、单克隆抗体的鉴定1杂交瘤细胞染色体

22、的检查 采用秋水仙素裂解法进行。2单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。3单抗的特异性鉴定 可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。4单抗的效价测定 可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5104。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。5必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。10: 杂交瘤细胞的冻存与复苏1 杂交瘤细胞的冻存 细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0后放入-70超低温冰箱，次日转入液氮中。2 细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性五、关键步骤与注意事项：1、整个制备过程需严格无菌2、细胞传代培养时注意适时更换培养液