宏基因组学的研究报告

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1、因组学研究进展及其应用摘要：本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对因组学展开论述，介绍了因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。关键字：因组学；因组学根本策略；文库构建与筛选；因组学研究进展及其应用引言：微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。仅原核生物（细菌和古细菌）即构成地球生物总量的的2550%1。自然条件下，包括病毒在的微生物,通过群落广泛参与C、N、O和S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免

2、疫反响，环境污染物降解等方面发挥着重要作用2。人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养根底上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%1%3，多达99%以上的微生物是不可培养的,其中蕴含着巨大的应用潜能其代产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物4。为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究5。因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。因组学以生境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。由于突破

3、了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛承受。尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不阻碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关因组学研究的文章逐年增多4。1. 因组学的概念因组(metagenome)的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组,而不是采用传统的培养微生物的基因组。因组的样本既包括可培养的微生物，也包括更大量的传统方法无法研究的不可培养微生物6。而所谓因组学(也称元基因组学Metagenomics、微生物环境基因组学MicrobialEnvironmentalGenomics、生态基因组学Ecogeno

4、mics)就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群构造、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作7。2. 因组学的根本策略及方法2.1 因组学的根本策略因组学的研究还处于初期开展阶段，但其研究的根本过程和根本策略已根本清楚。在此要强调的是，因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原那么指导下，基于特定生态环境根底上，依据整体、系统、动态变化和相互作用的观点，运用特殊的技术路线和方法，对研究围中所有基因组展开研究的学科。因组学是一种整体性的研

5、究策略，它建立在微生物基因组学的迅速开展和聚合酶链式反响广泛应用的根底之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从特定环境中直接别离所有微生物DNA,将大片段的DNA克隆到受体菌中表达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。82.2 因组学研究的根本方法因组学以基因组技术为根底，根本程序包括：环境样品中因组的提取，将DNA克隆到载体中;载体转化宿主细菌建立环境基因组文库，环境基因组文库分析和筛选。近年来，随着新一代高通量、低本钱测序仪的问世，因组的研究可对特定生境中的基因组片段直接进展测序而不用构建文库，从而防止了在文库构

6、建过程中利用细菌对样品进展克隆以及克隆中引起的偏差，简化了因组研究的根本操作，提高了测序效率，极促进了因组学开展9。2.2.1 因组DNA的提取环境样品DNA的提取是文库构建中最重要、最关键的一步，不仅要尽可能地将环境中所有微生物的DNA提取出来，还要保证一定的DNA片段长度和完整性。另外，环境样品中都含有一定的杂质（如土壤中的腐殖酸类物质），这些物质可抑制分子克隆中多种酶的活性，因此必须将其除去10。目的样品的采集须严格遵循取样规那么，使样品能最好地代表自然状态下的微生物状态9。根据提取因组前是否别离细胞，提取方法可分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法主要是通过去污剂处理（如SDS）,酶解

7、法（如蛋白酶K）等直接破碎样品中的微生物而使DNA得以释放。由于无须对样品微生物进展复性，且黏附于颗粒上的微生物细胞亦能被裂解，原位裂解所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性，且操作简单，本钱低，DNA提取率高。但该法提取的DNA片段较小（150kb），通常适用于构建小片段文库的DNA提取11。异位裂解法先用物理方法将微生物从样品中别离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA,可获得纯度较高的大片段DNA（20500kb），但该法操作繁琐，一些微生物基因组在别离过程中可能丧失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA抽提不出来，提取率较低且本钱高，通常适用于构建大片段插入文库的DNA提取12。2.

8、2.2 因组文库构建与筛选因组文库的构建沿用了分子克隆的根本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采取了一些特殊的步骤和策略。构建因组文库的技术主要包括：提取和纯化环境微生物DNA、选取适宜的克隆载体以及选择宿主菌株。根本原那么是以别离独立基因或者一些编码新代功能的小操纵子为目的时，以小插入片段载体（如质粒）构建文库，提取和纯化DNA时只需考虑纯度和物种的丰度13；而大插入片段文库（如Cosmid、Fosmid或者BAC）适合于获取编码复杂生物合成途径的大基因片段或者基因簇，但是构建这种文库需要提取和纯化更高长度和纯度质量要求的DNA。2.2.2.1 载体选择DNA提取后就可以构建

9、文库。在文库构建过程中，载体是文库构建所必需的因素,而且在活性物质筛选是也发挥极其重要的作用。载体选择的原那么主要考虑是否有利于目标基因扩增、表达及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。筛选目标物不同，其载体不同,筛选技术手段也有所不同。由于活性物质多是微生物的次生代物，其代途径由多基因调控。因此，有必要尽量插入大片段DNA以获得完整的代途径多基因簇，以期到达预期目的2.2.2.2 宿主选择宿主在筛选目标物的过程中起到至关重要的作用。选择宿主主要考虑重组体在宿主细胞中的稳定性、转化效率、因表达量、筛选的目标性状缺陷型(如溶血或抗菌)等因素。GUNNARHAGELINA等14指出，微生物种类不同，

10、其所产生的活性物质类型明显不同。因此，应结合不同的研究目的和筛选不同的活性物质考虑选择与其相适应的宿主菌株。2.2.2.3 因文库的筛选目前对环境因组文库筛选有3种途径:功能的筛选(functiondrivenscreening、)序列的筛选(sequencedrivenscreening)口底物诱导基因表达技术的筛选(substrateinducedgeneexpressionscreening,SIGE。X)由于因组的高度复杂性,需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可分为3类15，基于核酸序列差异分析的筛选、基于克隆子的特殊代活性(功能驱动)的筛选、基于

11、底物诱导基因的表达的筛选，也叫SIGEX法(Substrateinducedgeneexpressionscreeningmeth16o。d)2.2.3 因组文库的分析根据不同的研究目的，因组文库的分析可以从生物活性水平、化合物构造水平以及DNA序列水平设计不同的筛选方案，可分为功能分析和序列分析。2.2.3.1 功能分析根据重组克隆产生的新活性进展筛选,可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。功能分析法根据重组克隆产生的新活性进展筛选,可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质8。2.2.3.2 序列分析有2种主要方法:一

12、种是根据保守序列设计引物或探针，通过PCR扩增或杂交来筛选目的克隆。另一种方法是对含有16SrRNA等系统进化锚定基因的克隆进展测序。一个典型的因组分析涉及多个轮次,以确保从生态环境标本中别离到目,及尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。2.2.3.3 因组序列分析技术的进步近年开展起来的高通量基因组测序技术17，不需要克隆或PCR便能获取大量的DNA序列信息，相应地需要有新的方法来比拟这些因组数据，不断进步的序列分析技术以及众多生物信息学工具和数据库便利,如针对原核微生物因组进展分析的软件交互分析和比拟的因组分析工具MEGANDNA,所以给基因的鉴定归属带来很大困难有 5 kb 以上的片段可

13、进展有效的鉴定归类，这一问题21此外,比拟因组技术、基因芯片技术等均可用于分析因组序列18的出现将为因组数据的分析提供J Coas1t9、可对多组因组数据进展等 20。由于因组技术提取的是环境总（这一过程被称为binning） ，现今只DNA 条形码技术已被用来尝试解决22 。3. 因组学研究进展及其应用近年来,因组学研究已渗透到各个研究领域,包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术、农业、生物防御及伦理学等各方面显示出重要价值。在酶学开展方面因组学显示出强大的生命力，在发现新型酶以及有新型功能的酶方面已经取得一些进展23。3.1 应用因组开发新型

14、酶传统的新型酶的筛选方法大大限制了筛选的广泛性和有效性24。因组学那么克制了这一限制，通过直接从环境中提取DNA样品，尽可能为后面的筛选提供更加全面和多样的基因资源，从而有效地提高了新酶的筛选效率。一般来说，新功能酶的筛选主要还是基于活性筛选。这种不依赖于序列的方法总体上可对所有新酶的活性或特异性进展鉴定24。虽然，基于序列的筛选方法可能不像功能筛选那样具有较强的目标性但通过有目的地设计杂交探针或PCR引物,可一定程度地减少文库的容量，缩小筛选的围25。3.2 应用因发现新基因由于自然界多数微生物物种及其生物量是未知的，其中存在大量不可培养的微生物，无法通过培养法进展研究，而因组学的策略那么突

15、破了这一束缚。通过构建因组文库，而且从中鉴定出的大多数基因将都是新的基因8。3.3 应用因筛选医药因组学在现代医药学中扮演着极其重要的角色，对因组文库进展功能筛选的重要目标是筛选在医药业中具有重要应用价值的产物100如Doreen.E等26对土壤因组文库进展筛选，得到了2种新的抗生素TurbomycinA和B,这2种抗生素对革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物菌表现出广谱的抗性。4. 展望因组学研究将大大扩展我们对生命的了解，包括了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相互作用。因组技术通过对环境DNA的直接克隆,为研究和利用占微生物种类99%以上的未可培养微生物提供了新

16、的途径。随着新的科技方法的不断开展，因组的应用围将会越来越广泛。参考文献：1WhitmanWB,DCColeman,WJWiebe.Prokaryotes:TheunseenmajorityJ.ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(12):657826583.2AmannRI,BJBinder,RJOlsonetal1binationof16SrRNA2targetedoligonucleotideprobeswithflowcytometryforanalyzingmixedmicrobialpopulationsJ.ApplEnvironMicrobiol,1990,56(

17、6):191921925.3 TorsvikV,OvreasL.Microbialdiversityandfunctioninsoil:fromgenestoecosystemsC.urrOpinMicobil,2002,5(3):240-245.4 RiesenfeldCSetal.AnnuRevGenet,2004,38:525-5525 CowanD,MeyerQ,StaffordW,etal.Metagenomicgenediscovery:past,presentandfutureJ.TrendsBiotechnol,2005,23(6):32329.6 丛延广，胡福泉；因组学:根本

18、策略及在医学研究领域中的可能应用；CHEMISTRYOFLIFE2007,27(1)；1000-1336(2007)01-0010-027 美琴；JournalofAnhuiAgri.Sci.2021,36(2):415-416,4798 楚雍烈，娥；因组学及其技术的研究进展；JournalofXianJiaotongUniversity(MedicalScience，s)Vol.29No.6Dec.20219 蓉，胡永峰，金奇；因组学及其在医学微生物学领域的应用；CHINESEJOURNALOFVIROLOGY，Vol.25No.3May202110 马莉莉，宗浩，宋培勇；因组学研究环境微生

19、物的钥匙；JournalofAnhuiAgr.iSc.i2021,37(20):9377-937911 HenneA,RolfDaniel,RuthA.Schmitz,etal1ConstructionofEnvironmentalDNALibrariesinEscherichiacoliandScreeningforthePresenceofGenesConferringUtilizationof42HydroxybutyrateJ.ApplEnvironMicrobiol,1999,65(9):390123907.12 CourtoisS,MariaBallJLPernodet,etal1

20、RebinantEnvironmentalLibrariesProvideAccesstoMicrobialDiversityforDrugDiscoveryfromNaturalProductsJ.ApplEnvironMicrobiol,2003,69(1):49255.13 芦晓飞，罗坤，丙炎，茆振川；因组学及其在植物病害生物防治中的应用；ChineseJournalofBiologicalControl.2增刊6()106-112,Nov.202114GUNNARH,INGERO,RaknesaA,eta.lPreparativehighperformanceliquidchromat

21、ographicseparationandanalysisoftheMaltacineplexafamilyofcyclicpeptideantibioticsfromBacillussubtilisJ.JChromatogB,2004,811(2):24325115 阎冰,洪葵,许云,等因组克隆!微生物活性物质筛选的新途径J微生物学通报,2005,32(1):113117.16 DeLongEF,PrestonCM,MincerT,etalmunitygenomicsamongstratifiedmicrobialassemblagesintheoceansinteriorJScience,

22、2006(311):496503.17 盛桂莲,赖旭龙,侯新东.古DNA实验体系及技术J.中国生物化学与分子生物学报,2021,25(2):11612518 SinghJ,BehalA,SinglaN,etal.Metagenomics;Concept,methodology,ecologicalinferenceandrecentadvancesJ.BiotechnolJ,2021,4(4):4984019 RichterM,LombardotT,KostadinovI,etal.JCoastAbiologistcentricsoftwaretoolfordataminingandparis

23、onofprokaryotic(meta)genomesJ.BMCBioinformatics,2021,9(1):17718520 HusonDH,RichterDC,MitraS,etal.MethodsforparativemetagenomicsJ.BMCBioinformatics,2021,10(Suppl1):S1221 ZhouF,OlmanV,XuY.BarcodesforgenomesandapplicationsJ.BMCBioinformatics,2021,9(1):54655622 孟飞,俞春娜,王秋岩,恬;因组与因组学;ChineseJournalofBioche

24、mistryandMolecularBiology;ISSN10077626113870/Q2021年2月26(2):11612023 程凡升,蔡婷,金剑,生吉萍,申琳;水体因组学研究进展及应用;JOURNALOFBEIJINGUNIVERSITYOFAGRICULTURE,Vol.25,No.1Jan.202124 OhHJ,ChoKW,JungIS.ExpandingfunctionalspacesofenzymesbyutilizingwholegenometreasureforlibraryconstructionJ.JMolCatalB:Enzymatic,2003,26(3):24

25、1-250.25 PatrickLorenz,ChristaSchleper.MetagenomeachallengingsourceofenzymediscoveryJ.JMolCatalB:Enzymatic;2002,19(20):13-19.26 钱莉莉,少欣,史炳照;因组学在新型生物催化剂开发中的研究进展;JOURNALOFMICROBIOLOGYJuly2006Vol.26No.427 GILLESPIEDOREENE,BRADYSEANF,BETTERMANNALAND,eta.lIsolationofantibioticsturbomycinAandBfromametagenomiclibraryofsoilmicrobialDNAJ.ApplEnvironMicrobio,l2002,68(9):4301-4306