PDCDmRNA和miR在大肠癌中的表达及其临床意义

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1、温州医学院硕士学位论文PDCD4mRNA和miR-21在大肠癌中的表达及其临床意义 中文摘要目的1探讨miR-21和PDCD4mRNA在大肠癌中的表达及其与临床病理特征的关系2阐述在大肠癌活体组织中miR21的表达与其PDCD4mRNA和PDCD4蛋白表 达的关系方法1SYBR Green I为染料的实时荧光定量PCR技术检测43对大肠癌组织及其对 应的正常粘膜组织的miR-21和PDCD4 mRNA的表达量 2采用免疫组化sP法检测43对大肠癌组织及其对应的正常粘膜组织的PDCD4 蛋白的表达结果1在大肠癌组织中miR21相对表达量的中位数为1423，其配对的正常粘膜 织相对表达量的中位数为

2、1000，两者的差异具有统计学意义(pO01)。2在大肠癌组织中PDCD4mRNA相对表达量的中位数为1000，其配对的正常粘膜组织相对表达量的中位数为2166，两者的差异具有统计学意义(p001)。 3在大肠癌组织中，有、无淋巴结转移的miR21表达的中位数分别为10092、7875，两组之间的差异具有统计学意义(pO05)；分期III+IV和I+II的miR21表达 的中位数分别为12605、7771，两组之间的差异具有统计学意义(pO05)。 4在大肠癌组织中，浸润深度T3和TI+T2的PDCD4mRNA表达的中位数分别为0086、4192，两组之间的差异有统计学意义(p005)；临床分

3、期II和I PDCD4mRNA 的表达的中位数分别为0084、20821，两组之间的差异有统计学意义(p005) 5miR21的表达与PDCD4蛋白的核表达、核与浆表达之和存在负相关(pO05)结论1高表达的miR-21与大肠癌的淋巴结转移和临床分期(III+IV、I+II)有关2低表达的PDCD4mRNA与大肠癌的浸润深度和临床分期(II、I)有关3在大肠癌组织中，高表达的miR-21和低表达PDCD4mRNA可提示大肠癌的不6塑型匡堂堕堡主堂垡笙銮一良预后 4在大肠癌活体组织中，miR21可通过与PDCD4mRNA的3非编码区结合抑制 PDCD4mRNA翻译成蛋白质。关键词结直肠肿瘤；微R

4、NA21；临床病理特征；程序性细胞死亡因子4温少I,I医学院硕士学位论文。一一_E xpression and chnlcal slgmficance of PDCD4m心A a。ndjmiR-21 and in human一6lorectal cancerabstract矿睡VeFo investigate the expression of miR-2 1 and PDCD4mRNA in colorectal callcer and渤eir correlation with Clinicopath0109ical characteristicsk elucidate relationsh

5、ip of PDCD4mRNA、PDCD4 protein and miR2 1 in viVo奠pression of miR_2 1 and PDCD4mRNA were detected by Quantitative realtime+、二ianscriptase-PCR base on SYBR Green I in 43 cases of colorectal carcinoma aJld。,ivsponding normal mucous membrane tissue；i一醇D4 protein expression were inspected by SP immunohis

6、tochemical staining in 43_颂torectal carcinoma and matched normal mUCOUS membrane tissue；r。li吣median of relative expression level of miR-2 1 was 1423 in colorectalH s置and 1000 in matched normal tissue，significant differences were obseed、。!一11em(p001)。median of relative expression level of PDCD4mRNA w

7、as 1000 in colorectal 7，。_姒，and 21 66 in their corresponding normal controls，significant differences、vere，。tween them(p001)，：colorectal carcinoma，the median of miR-2 1 normalized by U6 were 1 00927875 elY for lymph node positivity group and negativity group，12605，7771 、，：。】Y for stageslII and IV gro

8、up and stages I and II group，significant differences 一。硌：矧ed between two groups above(p005、colorectal carcinoma,the median of relative expression of PDCD4mRNA were。1 92 respectively for T3 group and T1 and T2 group，0084，20821respectively for；：oup and stages I group，significant differences were found

9、 between two groups?p：n05)On the other hand，no significant differences were found concerning8sexsite,size，lymph node metastasis，distant metastases(pO05)5MiR2 1 levels was negatively correlated with PDCD4 expression including nuclearand sum of the nuclear and cytoplasmic(pO05) Conclusion1Up-regulatio

10、n of miR-2 1 was associated with lymph node metastasis and clinicalstages(I+II、Ill+IV)(P005)2Down-regulation of PDCD4mRNA was associated with local invasion，clinical stages(I、II)(P18)。32microRNA提取：用miRcute miRNA提取别离试剂盒提取 1样品处理：将组织在液氮中磨碎。每3050mg动物组织加1 ml裂解液MZ，样品 体积不应超过裂解液MZ体积的十分之一。 2室温放置5min，使得核酸蛋白复合

11、物完全别离。34 0C 12，000 rpm离心5分钟，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。 注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节局部等，可加此步骤 离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上 清溶液中。4参加2001xl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min。5412000 rpm离，1二,15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相， RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液MZ试剂的50。把水相转移到新管 中，进行下一步操作 6量取500Itl转移液的体积，缓慢参加转移液体积15倍的无水乙醇(即7

12、50肛l无水乙醇)， 混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入miRspincolumn中，室 温12，000 rpm离一l,30s，假设一次不能将全部溶液和混合物参加miRspin column，请分两温州医学院硕士学位论文一一l_。一一次转入，离心后弃掉流出液，保存miRspin column。7向mi风pin c01l】mn中参加500“l去蛋白液MRD(请先检查是否已参加乙醇)，室温静 置2min，室温12，000 rpm离1二,30s，弃废液。 81台lmiRspincolumn中参加700“l漂洗液RW(请先检查是否已参加乙醇)，室温静置2rnin，室温12，000

13、rpm离一1二,30s，弃废液。9向miRspin eolumn00 NN500山漂洗液RW，室温静置2min，室温12，000 rpm离心 30s，弃废液。10将miRspin column放入2ml收集管中，室温1 2，000 rpm离心1 rain，去除剩余液 体。注意：此步骤目的是将吸附柱中剩余的漂洗液去除，离心后将miRspin column在室 温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能 会影响后续的RT等实验操作。11将miRspin column转入一个新的15ml离心管中，加70 rtl RNase-free ddH20，室温 放置2min，室

14、温1 2，000 rpm离一5,2min。洗脱缓冲液体积不应少于30 Ill，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在一70*(2，以防降解。 33逆转录反响331 miR-21的逆转录反响：用茎环引物进行miR-21的逆转录反响(总体积2091)： 反响体系为：10ng模板RNA，50nMIA茎环引物，1UglRNA抑制酶(Fermentas公司) 5Ugl逆转录酶(Invitrogen公司) 005mMlxldNTP，41xl5 X FirstStrand Buffer951xlDEPC处理水反响条件如下：1 6。C 30min，42。C 30min，75。C 1 5min，4。C保存。33

15、2 PDCD4mRNA的逆转录反响：用oligodT引物进行逆转录反响，反响体系同上， 反响条件如下：42。C 60rain，75。C 1 5min，4。C保存。34 SYBR Green I荧光定量PCR：PCR mix采用SYBRPremix Ex TaqTM II(TaKaRa)，20I，tl体系如下：试剂使用量SYBRPremix Ex TaqTM II(2 x)109lPCR Forward Primer(1 09M)O89l温州医学院硕士学位论文PCR Reverse Primer(10“M)08“lDNA模板201xldH20(灭菌蒸馏水)649lTotal2009l反响条件如下

16、：预变性95。C30s95。C5s60。C34s共40个循环，以U6为内参，所有实验重复3次35RT-PCR的引物序列(见表2)表2RT-PCR的引物序列名称引物序列miR-21的茎环引物5-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCATTCAGTrGAGTCAACATC-3miR-21上游引物5-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA3 miR21下游引物5-TGGTGTCGTGGAGTCG3 PDCD4mRNA上游引物5CAGTTGGTGGGCCAG丁r瞄iITG3 PDCD4m鼬、A下游引物5-AGAAGCACGGTAGCCrnTCCA3u6的上游引物5-CT

17、CGCTTCGGCAGCACA一3U6的下游引物5AACGCTTCACGA pdTTGCGT-336聚丙烯酰胺核酸电泳：361miR-21 PCR产物用10的聚丙烯酰胺凝胶进行核酸电泳，凝胶配方如下：10聚丙烯酰胺凝胶体积(m1)H206930丙烯酰胺505TBE3O10过硫酸铵O11TEMEDO010362 PDCD4mRNA PCR产物用5的聚丙烯酰胺凝胶进行核酸电泳，凝胶配方如下：5聚丙烯酰胺凝胶体积(m1)H209430丙烯酰胺255TBE3O10过硫酸铵01 1TEMED001017温州医学院硕士学位论文 37免疫组化SP法将43对组织进行石蜡包埋，41xm厚连续切片，SP法步骤具体

18、如下： 1烤片，68，30分钟。2脱蜡、水化组织切片： 二甲苯I20min二甲苯II20 min 无水乙醇I15min 无水乙醇II15min 95乙醇10min80乙醇10min70乙醇10min3阻断内源性过氧化物酶：3H202室温20min，PBS冲洗3X5min。4高压抗原修复：置于O01M柠檬酸盐缓冲液(PH 6O)中高压修复2min，自然冷却至 室温，用PBS冲洗3X5min。5正常山羊血清工作液封闭，室温孵育20 min，甩去液体，勿洗。6滴加一抗37孵育lh，PBS冲洗3X5min。7滴加二抗工作液中杉金桥公司的PV6001(辣根酶标记的羊抗兔多聚体)，37。C孵育 30min

19、，PBS冲洗3X5min。8DAB显色约2min，自来水冲洗10min。9苏木素复染10s，自来水冲洗10min。10盐酸酒精分化4s，自来水冲洗5min。11脱水，透明： 70乙醇5min80乙醇5min95乙醇5min 无水乙醇II5min 无水乙醇I5min二甲苯II5 min二甲苯I5min12树胶封片。4免疫组化染色的结果判定：判定标准参照文献17】，具体如下：核染色根据肿瘤细胞染色范围：阳性细胞 O为0分、30为1分、3070为2分、70为3分；浆染色根据染色强度分 为：无染色为0分、弱染色为1分、中等染色为2分、强染色为3分；总染色为两者一塑型堕堂堕堡主兰垡笙茎相加。在浆、核PD

20、CD4表达中，积分1分为低表达，1分为高表达，在浆+核PDCD4 蛋白的表达中，积分2分为低表达，2分为高表达5统计学方法：应用SPSSl30软件进行统计分析，比拟肿瘤和正常组织之间的差异采用配对的 wilcoxon秩和检验，分析miR-21、PDCD4mRNA与临床病理特征的关系采用MannWhitnev U检验，miR-21、PDCD4mRNA和PDCD4蛋白之间的关系采用spearman 相关性分析。检验水准or=00519温州医学院硕士学位论文结果1miR一21和PDCD4mRNA在大肠癌中的表达 在43例大肠癌患者中6512(2843)的患者miR21表达增高，miR21在大肠癌组织

21、中表达的平均CT值(相对于U6)为：9842+1。l 81，其配对的正常组织表 达的平均CT值(相对于U6)为：_8830土2928，用2ct法表示癌组织相对正常 组织的变化倍数，故大肠癌组织miR一21的表达是正常组织的2017倍，在大肠癌组 织中miR21相对表达量的中位数为1423，其配对的正常粘膜组织相对表达量的中位 数为1000，用配对的wilcoxon秩和检验，两者的差异具有统计学意义(p=0002001)。在43例大肠癌患者中558l(2443)的患者PDCD4mRNA表达下降，PDCD4mRNA在正常大肠粘膜中表达的平均CT值(相对于U6)为：6933+4233，大肠癌 组织表

22、达的平均CT值(相对于U6)为：5865土3497，用2一ct法表示正常粘膜 组织相对癌组织的变化倍数，故正常组织中PDCD4mRNA的表达是大肠癌组织中的 2098倍，在大肠癌组织中PDCD4mRNA相对表达量的中位数为1000，其配对的正 常粘膜组织相对表达量的中位数为2166，两者之间的具有显著的统计学差异(p=000200 1)2miR一21和PDCD4mRNA的电泳结果 miR2l和PDCD4mRNA的PCR产物分别用10和5的聚丙烯酰胺进行核酸电泳，PCR产物长度为：PDCD4mRNA：13lbp；miR一21：66bp，U6：94bp。MiR一2l和 PDCD4mRNA电泳的结果

23、分别见见图2和图3，电泳结果目的条带均一，未见非特异 性扩增条带。234100b50bp图2示大肠正常粘膜及其癌组织miR一21和U6PCR产物电泳图M：maker，l：正常粘膜U6，2：癌组织U6，3：正常粘膜miR一2l，4：癌组织miR2120温州医学院硕士学位论文56M78150bp100bp图3示大肠正常粘膜及其癌组织PDCD4RNA和U6 PCR产物电泳图M：maker，5：正常粘膜U6，6：痛组织U6，7：F常粘膜PDCD4mRNA，8：煽组织PDCD4mRNA3miR2l和PDCD4 mRNA与大肠癌临床病理特征的关系 大肠癌中有、无淋巴结转移的miR一21表达的中位数分别为1

24、0092、7875，两组之间的差异具有统计学意义(p=0029005)；大肠癌分期IIl+1V和I+II的miR一2 l 表达的中位数分别为12605、7771，两组之间的差异具有统计学意义(p=O013005)；临床分期II和I miR一21的表达的中位数分别为7582、 7771，两组之间的差异无统计学意义(p=0851005)，而miR一2l表达与患者的性别、 肿瘤位置、肿瘤大小、有无远处转移均无关(p005) (见表3)低表达PDCD4mRNA与大肠癌的浸润深度和临床分期有关。浸润深度T3和TI+T2的PDCD4mRNA表达的中位数分别为0086、4192，两组之间的差异有统计 学意义

25、(p=0005005)；临床分期II和I PDCD4mRNA的表达的中位数分别为0084、 20821，两组之间的差异有统计学意义(p=0006005)；临床分期III+和I+II的PDCD4mRNA的表达的中位数分别为 0130、O778，两组之间的差异无统计学意义(p=0245005)。PDCD4 mRNA的表 达与患者的性别、肿瘤位置、肿瘤大小、有无远处转移均无关(pO05)(见表4)表3miR-21的表达与大肠癌临床病理特征的关系。一临床病理参数例数miR-218的表达P值_一一一_一性别奇1710092(5255-15917)0563辱268406(629310976)肿瘤位置结肠1

26、29661(525514252)O862直肠318563(652113456)肿瘤大小直径；，4cm219762(658222650)0157直径4cm228114(422010965)浸润深度TI+T2167536(44789966)0123T3279762(652 120565)淋巴结转移无267875(52691 0976)0029有1710092(709729781)远处转移无408406(576812582)0127有3151 17(8677-65533)临床分期I+II257771(4932-10745)0013III+181 2605(71 99-29554)或I11777 1(

27、42609587)O8512miR21的表达：标化的miR-21的表达量温型垦堂堕堡主堂垡笙銮l一。表4PDCD4mRNA的表达与大肠癌临床病理特征的关系临床病理参数例数PDCD4mRNAb的表达P值 性别古17O167(00224821)O369罩261855(O03419207)肿瘤位置结肠O685(0051187202)O512直肠他O462(O0218439)肿瘤大小直径4cm1204(0059-14707)0379 直径005)、与浆中表达的，；(。D4蛋白无关(p005)，而与核中表达的PDCD4蛋白、PDCD4总蛋白的表达(浆。#在明显的负相关(p0057奠、159廷1)4蛋白?

28、，。48041500120052410,)CD4蛋211一71 1-046700041分为高表达 浆十核PDCD4蛋白的表达中，积分2分为低表达，2分为高表达24温州医学院硕士学位论文 5大肠癌及正常粘膜组织中PDCD4蛋白表达的免疫组化图正常大肠粘膜组织，SP染色400大肠癌组织，SP染色400 核表达缺如，阳性细胞数0，核表达积分为0分温州医学院硕士学位论文一“-覃引蚓铲泸。，大肠癌组织，SP染色400 阳性细胞数30，核表达积分为1分大肠癌组织，SP染色400阳性细胞数3070，核表达积分为2分温州医学院硕士学位论文大肠癌组织，SP染色400阳性细胞数70，核表达积分为3分寸一大肠癌组织

29、， SP染色400大肠癌细胞浆无染色， 故浆表达的积分为0分温州医学院硕士学位论文大肠癌组织，SP染色400 大肠癌细胞浆为弱染色，浆染色积分为1分大肠癌组织，SP染色400 细胞浆为中等染色，浆染色积分为2分温州医学院硕士学位论文一一大肠癌组织，SP染色400 细胞浆为强染色，浆表达的积分为3分温州医学院硕士学位论文分析和讨论近来，发现一类非编码的微小RNA，约20个核苷酸组成，主要通过与靶mRNA 3 非编码区结合降解或抑制其翻译，从而负性调节靶基因的表达。肿瘤的发生和开展与 细胞基因的异常表达密切相关，因而，对肿瘤中异常表达的micrRNA及其靶基因的 研究意义重大。这不仅从microR

30、NA的角度阐述肿瘤的发生和开展的机制，而且为肿 瘤的临床诊断和治疗提供新的分子指标。研究发现miR21在许多实体瘤中表达上调，包括乳腺癌【l 81，肝癌【19J等。MiR21 可以调节多个靶基因的功能。主要包括PTEN和PDCD4基因。Zhang BGl201等研究表 明高表达的miR-21通过抑制基因PTEN的表达，从而促进胃癌的增殖、侵袭和转移。 Lou y21】等敲除miR21后，卵巢癌细胞PTEN的表达增高，故认为miR-21可能通 过抑制靶基因PTEN的表达促使卵巢癌细胞的侵袭和转移。Reis PP221等报道高表达 的miR-21可通过与PDCD4mRNA的3非编码区结合抑制其表达

31、，从而促进口腔鳞癌 的侵袭和转移。Cao Ztll】等研究说明在胃癌中miR-21同样具有负性调节靶基因PDCD4 的功能。此外，miR-21还具有负性调节靶基因TMl231、TPMll241、JAGl和wNTl【251。PDCD4是一种抑癌基因，又称为细胞凋亡因子4，在许多实体瘤中，PDCD4表 达下调，包括大肠癌u61，卵巢癌【261，肺癌【27】等，PDCD4的表达具有抑制细胞的恶性 转化、致癌和侵袭的作用28-291，PDCD4主要与真核生物翻译起始因子elF4A和elF4G 相互作用po。33】，抑制蛋白质的翻译来发挥作用的，这些蛋白包括JNKcJunAP1【3435】， p2113

32、6j。Mudduluru Gtl o】等检测71对大肠癌、正常粘膜组织以及42个腺瘤组织的 PDCD4蛋白的表达，结果说明从大肠正常粘膜组织、腺瘤组织到大肠癌组织，PDCD4 蛋白的表达逐渐降低，并且认为PDCD4蛋白的表达是大肠癌独立的预后因素。本研究显示6512(2843)的患者miR21表达增高，与Motoyama K112在胃癌 中报道的654很接近。先前的研究说明PDCD4mRNA在肿瘤中下降的比例大约在 47一571t37-38，本研究的比例是5581正好在这个范围内， 而PDCD4mRNA表达下降的主要原因是PDCD4基因的5CpG甲基化而导致的眇J，但是在胃癌中 PDCD4mR

33、NA表达下降的比例为77，远远超出了上述的范围，提示在胃癌中还存 在其他机制造成PDCD4mRNA的表达下降，可能的原因是在胃癌中高表达的miR-21 在转录后水平降解PDCD4mRNA所造成的【12J。本研究显示miR-21的表达与淋巴结转移、临床分期(I+II，III+IV)有关，而 与大肠癌的远处转移无关，与Slaby 0401等报道的根本一致，不同点是Slaby O认为 miR21的表达还与大肠癌的远处转移有关，这可能是由于远处转移患者所占的比例温州医学院硕士学位论文 不同造成的，本研究中远处转移的患者占6977(343)，而Slaby O研究的对象中远处转移的患者占31034(929

34、)。本研究首次报道PDCD4mRNA在大肠癌中的表 达及其与临床病理特征的关系，研究显示PDCD4mRNA的表达与大肠癌的浸润深度、 临床分期(I，II)有关，而与患者的性别、肿瘤位置、肿瘤大小、远处转移、临床 分期(I+II，III+IV)无关。提示PDCD4mRNA与miR-21与大肠癌的预后有关，可 能成为大肠癌生物治疗的新靶点。microRNA具有负性调节靶基因的功能，主要是与靶基因表达的mRNA的3非编 码区结合直接降解mRNA或者抑制mRNA的翻译。先前已经有文献报道在大肠癌细 胞株中miR-21的表达与PDCD4靶蛋白的表达存在负相关，而与PDCD4mRNA的表 达无关，但在22

35、例大肠癌的活体标本中miR-21的表达与PDCD4mRNA的表达存在 微弱的负相关14，可能是临床例数缺乏导致根底和临床研究不一致，所以本研究试图 增加例数来进一步说明大肠癌活体标本中miR21的表达与PDCD4的关系。结果显示 miR-21的表达与PDCD4mRNA的表达无关，而与总PDCD4蛋白表达存在明显的负 相关。 本研究还显示miR-21的表达还与PDCD4蛋白的核表达存在负相关性，这与 Fassan Mt42】报道一致。提示miR21在转录后水平与PDCD4mRNA的3非编码区结合u纠抑制PDCD4mRNA翻译成蛋白质，而无直接降解PDCD4mRNA。而Motoyama K对胃癌细胞株和49例胃癌组织进行研究，认为miR-2 1在转录后水平与PDCD4mRNA 的3。非编码区结合，不仅抑制PDCD4mRNA翻译成蛋白质，而且降解PDCD4mRNA， 这可能是临床上胃癌患者预后比大肠癌患者差的原因之一。综述所述，PDCD4mRNA在转录水平前，主要通过PDCD4基因5CpG甲基化导 致PDCD4mRNA的表达降低，PDCDmRNA降低与大肠癌的浸润有关，而与转移无 关。而高表达miR-21与大肠癌的淋巴结转移有关，主要在转录水平后通过与PDCD4 mRNA的3-非编码区结