烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

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1、2011-08, 32 (4)中国烟草科学 Chinese Tobacco Science31烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化王卫锋，太帅帅，王 鲁，刘贯山，李凤霞，高晓明，孙玉合*（农业部烟草类作物质量控制重点开放实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛266101）摘 要：腋芽的形成涉及多个调控基因，其中关键基因编码的蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族，它的突变或功能缺失将影响腋生分生组织的形成。笔者利用RACE技术克隆了烟草 NtLS基因（GenBank登录号EU935581），NtLS与调控植物腋生分生组织形成的基因 LS/LAS/MOC1序列高度相似。本研究从该基因上

2、选取干扰片段，构建了含有反向重复序列的RNAi干扰表达载体，并通过农杆菌侵染的方法转染烟草W38，以期为NtLS基因的功能研究奠定基础。关键词：烟草；NtLS; RNA干扰中图分类号：TS413文章编号：1007-5119（2011）04-0031-05 DOI : 10.3969/j.issn.1007-5119.2011.04.008Construction of RNAi Vector ofNtLS Gene and its Transformation in TobaccoWANG Weife ng, TAI Shuaishuai, WANG Lu, LIU Gua nsha n, L

3、I Fe ngxia, GAO Xiaomi ng, SUN Yuhe(Key Laboratory of Tobacco Quality Control, Ministry of Agriculture, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Qingdao 266101, China)Abstract: Axillary bud formation involves many regulatory genes, one of key factors belongs to the plant

4、specific protein family GRAS. Mutation or function missing of these genes would affect the axillary formation. The tobacco NtLS gene (EU935581) was cloned by RACE technology in our lab. The sequences of NtLS are highly similar to those of LS/LAS/MOC1, which regulate the formation of axillary meriste

5、ms. The interference fragments were chosen fromNtLS and the RNAi expression vectors wereconstructed and transformed into Nicotiana tabacum W38 by agrobacterium-mediated leaf disc transformation methods, to form basis for further study of NtLS function.Keywords: tobacco; NtLS; RNAi 1 *4-2012 Chirui A

6、cademic Journal Ekctronic PuKlijihing House. All rights reserved, http:/wavi. Jidt2011-08, 32 (4)中国烟草科学 Chinese Tobacco Science#烟叶生产中，打顶之后烟株上的腋芽会迅速发 生。腋芽的生长会消耗大量养分，如不及时去除， 将导致烟叶产量减少，品质下降。目前去除腋芽主要靠人工抹杈和使用抑芽剂。人工抹杈不但费工 费时，而且抹杈造成的伤口利于一些病原菌的入 侵，容易造成病害传播2。而抑芽剂多为有机合成， 存在着影响烟叶品质、毒性残留以及环境污染等冋 题，而且使用成本较高。从腋芽形

7、成的分子机理入 手，利用分子育种手段可能是解决烟草腋芽问题的 一条有效途径。腋芽的形成由胚后发育形成的腋生分生组织 决定，在腋生分生组织形成过程中涉及多个调控基 因，女口 LS、LAS、MOC1等，这类基因编码的 基金项目：国家烟草专卖局重点资助项目（110200701021）蛋白属于植物特有的 GRAS蛋白家族，它们的突变 或功能缺失将影响腋生分生组织的形成。本研究利 用RACE技术克隆了烟草 NtLS基因（Gen Ba nk登 录号EU935581 ），该基因的全长 cDNA序列为1 847 bp，编码区为1 224 bp，编码407个氨基酸，基因 序列不含有内含子。NtLS与调控植物腋生

8、分生组 织形成的基因 LS/LAS/MOC1序列高度相似。为了 明确NtLS的功能，经过序列比对分析，我们从该 基因上选取干扰片段，构建了含有反向重复序列的 RNAi干扰表达载体pART27-FR，并通过农杆菌侵 染的方法转化烟草品种W38，获得了转化烟草幼苗，为从分子手段研究烟草腋芽形成与控制奠定了 基础。 1 *4-2012 Chirui Academic Journal Ekctronic PuKlijihing House. All rights reserved, http:/wavi. Jidt2011-08, 32 (4)中国烟草科学 Chinese Tobacco Scienc

9、e32作者简介：王卫锋，男，硕士，研究方向为烟草分子育种。E-mail: sdwangweifeng。*通信作者，E-mail: yhsun收稿日期：2010-06-21 1 *4-2012 Chirui Academic Journal Ekctronic PuKlijihing House. All rights reserved, http:/wavi. Jidt34中国烟草科学2011年第32卷1材料与方法1.1 材料用于载体构建的基本质粒pKANNIBAL 和PART27 由 Peter M. Water-house 实验室惠赠。烟草 品种W38及根癌农杆菌菌株 EHA105为本实验

10、室 保存。大肠杆菌感受态菌株（DH5 a）、植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化有限公司，Taq酶、限制性内切酶、质粒小提试剂盒、DNA片段纯 化试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒购自大连宝 生物生物工程有限公司， T4 DNA连接酶购自NEB 公司，小牛小肠碱性磷酸酶（ CIAP ）购自MBI公 司，其他试剂为国产分析纯产品。1.2方法1.2.1干扰片断的选择及引物设计选取NtLS基因上的非保守区段 7081 041 bp间长334 bp的序列 作为干扰片段。根据干扰片段的碱基顺序以及 pKANNIBAL 上intron两端的限制性内切酶位点， 分别设计正、反向插入片段的扩增引物。正向片段 引

11、物 F1 ： ata ctc gag CGA TCC ACA TCG TTG ATT TTG（引入 XhoI 酶切位点）,F2 : ata ggt acc ATC CTT AAC TTT TCG CGG TCT T （引入 Kpnl 酶切位点）, 预期扩增片段为352 bp;反向片段引物 R1 : ata tct aga CGA TCC ACA TCG TTG ATT TTG （引入 XbaI 酶切位点）,R2: ata aag ctt ATC CTT AAC TTT TCG CGG TCT T （引入Hindlll酶切位点），预期扩增片 段为352 bp。1.2.2正、反向片段扩增及中间载体

12、构建以烟草W38基因组DNA为模板，分别利用正、反向片段 引物进行扩增。PCR反应程序为：94 C变性30 s, 57C复性30 S, 72 C延伸45 s, 30个循环后72C延 伸7 min PCR产物经纯化后，分别利用XhoI/Kpnl、 XbaI/Hindlll两对限制性内切酶和 T4连接酶，将正、 反向片段插入pKANNIBAL上的多克隆位点，构 建中间载体 pKANNIBAL-FR ，连接产物转化大肠 杆菌感受态细胞（DH5 a）,在含有 Kan （50 mg/L） 的LB培养基上进行筛选，挑取单菌落经扩大培养 后提取质粒，进行Xhol/Xbal双酶切鉴定。1.2.3 RNA 干扰

13、表达载体的构建用Notl分别酶切中间载体 pKANNIBAL-FR 和表达载体 pART27 , 电泳回收 RNAi表达序列和酶切后的 pART27。T4 连接酶连接RNAi表达序列与CIAP处理酶切后的 pART27 ,连接后的转化、筛选、及酶切鉴定同1.2.2 , 并送大连宝生物生物工程有限公司进行测序，测序 上游引物为：CTA TCC TTC GCA AGA CCC T ，测 序下游引物为：TAG GCG TCT CGC ATA TCT C , 将构建正确的RNAi干扰表达载体命名为 pART27-FR。1.2.4 农杆菌介导转化及转化体筛选采用冻融8法将pART27-FR导入农杆菌 E

14、HA105，叶盘法 转化烟草W38。转化体筛选的 MS培养基中含有 Kan （100 mg/L）和 Carb （300 mg/L）。1.2.5转化烟草幼苗的 PCR检测以转化烟草幼 苗的基因组总DNA为模板，根据RNAi表达序列 上35S启动子、正（反）向特异片段以及终止子的 序列，分别设计针对转化烟草幼苗的正（反）向插 入片段的检测引物。正向插入片段检测引物PF-1：CCA CTA TCC TTC GCA AGA CC , PF-2: CGG TCT TTC AAG AGC CTG TG，扩增片段大小为 388 bp。 反向插入片段检测引物 RT-1: TTA CAG TTG GGA AAT

15、 TGG GTT CG , RT-2: CAT AGG CGT CTC GCA TAT CTC ,扩增片段大小为 411 bp。扩增片段 回收、纯化后，进行测序。2 结果2.1正、反向片段的 PCR扩增以W38基因组DNA为模板，分别用携带有酶 切位点的正、反向引物进行PCR扩增，电泳检测扩 增产物，扩增片段大小与预期一致。将目的条带回 收进行酶切反应。2.2 中间载体pKANNIBAL-FR 的酶切鉴定纯化后的正反向片段分别利用Xhol/Kpnl、Xbal/HindHI两对限制性内切酶和 T4连接酶，对应 插入在pKANNIBAL 多克隆位点上，经 Xhol/Xbal 双酶切鉴定，酶切片段大

16、小与预期大小一致，说明 1 *94-2012 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights 第4期王卫锋等：烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化35已成功构建了中间载体pKANNIBAL-FR ，形成在PPDK）内含子序列两边分别含有正、反向NtLS基因丙酮酸磷酸双激酶（pyruvate orthophosphate dikinase,特异片段的RNAi表达盒（图1 ）。 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al

17、rights reserved, http:Anki.iidt第4期王卫锋等：烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化# 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Anki.iidt第4期王卫锋等：烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化#CaMV35S启动子NotI XhoIPPDK内含子OCS终止子forward fragme ntreverse fragme nt日川冷川险图1 NtLs - RNAi表达盒示意图Fig. 1 Expres

18、sion box of NtLS-RNAi注: forward fragment:正向插入的s基因的352 bp片段；reverse fragment:反向插入的 基因的352 bp片段 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Anki.iidt第4期王卫锋等：烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化# 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights res

19、erved, http:Anki.iidt第4期王卫锋等：烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化362.3 RNA干扰表达载体pART27-FR的测序鉴定将构建的干扰表达载体送大连宝生物生物工 程有限公司进行测序，测序结果表明已成功构建了RNAi干扰表达载体 pART27-FR （图2 ）。2.4转化烟草幼苗的 PCR检测以转化烟草幼苗的基因组总DNA为模板，以正向插入片段检测引物 PF-1和PF-2进行PCR扩 增；以反向插入片段检测引物 RT-1和RT-2进行PCR 扩增。电泳检测PCR扩增结果表明，RNAi干扰表 达载体pART27-FR已成功转入烟草 W38中（图3）。 3

20、讨论RNA干扰（RNAi ）在许多生物中普遍存在， 在真核生物中RNAi的功能主要表现在抵抗病毒复 制表达、抑制转座子转座以及调控基因表达等方 面，利用RNAi技术对于研究植物基因功能和转基 因植物具有积极的意义。目前，植物RNAi介导的方法主要包括正义 RNA介导的共抑制、反义 RNA 介导的基因抑制、病毒介导的基因沉默（virusinduced gene silencing , VIGS ） 和 hpRNA 介导的基9因沉默。其中，VIGS法采用幼苗或植株局部接种 的方式，不能稳定遗传，因而无法对萌发期和幼苗10期表达的基因功能进行研究。正义RNA介导的共抑制和反义RNA介导的基因抑制的基

21、因沉默效 率为0%30% ,而hpRNA介导的基因沉默效率可 达到48%100%7。hpRNA介导的基因沉默已成 为RNAi研究的热点，它具有有效率高、干扰作用 持久、可稳定遗传给子代、应用范围广泛等优点11。 RNAi干扰载体构建过程中，干扰片段的长度和在 靶基因中的位置将影响 RNAi的效率和效果9。因此，干扰片段的选择是RNA干扰实验中的一个重要环节。一般情况下，选择的干扰片段长度应在 90900 bp之间，选择的区段可以在基因的内部编 码区，也可以在3 或5 端的非编码区， 对于300 bp以上的干扰片段，基本可以保证被加工后所得的 前体中包含能够有效进行 RNA干扰的dsRNA。此

22、外，为了避免非特异性RNA干扰的发生，在选择干扰片段时，对于基因的保守区域应该谨慎对待。 在对烟草幼苗的检测过程中，也分别根据启动子和 终止子序列设计了 PCR扩增引物，试图对包括正向 插入片段、内含子以及反向插入片段的区域进行扩 增。但是，这样的尝试都没有成功，这很可能是由 于该片段序列特殊，能够自身形成发夹结构，使引 物不能与模板结合，导致 PCR反应无法继续进行。 植物中存在着多条调控腋生分生组织形成的途径， 对拟南芥的研究表明，LAS和RAX是两条相对独立 的调控途径，LAS在REV的上游起作用，而 RAX 在CUC2的上游起作用，REV和CUC2又进一步对 分生组织标记基因（STM）

23、进行调控，LAS和RAX 在功能上可能存在一定的互补4,12。由于植物中存在着多条调控腋生分生组织形成的途径，NtLS基因被RNA干扰后，腋生分生组织的形成可能会从其 他途径得到补偿，本研究中，对于转基因阳性烟草 的鉴定是在DNA水平的PCR检测，转基因阳性植 株中NtLS基因在时空表达上的差异，还需进一步 在RNA和蛋白质水平上进行研究，并结合植株形 态观察，以确定 NtLS基因的表达抑制效果及腋芽 发生的变化。 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Ank

24、i.iidt第4期王卫锋等：烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化# 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Anki.iidt37中国烟草科学2011年第32卷 1 *4-2012 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved,http:/ki.iidt38中国烟草科学2011年第32卷XbjlkdnKpmXhdlFmidisdliignHi35s p

25、romolrXhol+ KpnlDigestionLigationintronKpnl4F-inorl 1pKANINIBAL*F6418 b pXh&l35s promoterHindIII+ XbaIDigestionLigationR-lnwrtHindlllintro hpKANNlBAL-FR6777 bpiKpnlj Finert35s promotes 忖計NotI DigestionarWEft2弓川oncokE!Ligation图2 RNA 干扰表达载体 pART27-FR的构建Fig.2 Construction of pART27-FR expression vector

26、 1 *4-2012 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved,http:/ki.iidt第4期王卫锋等：烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化391 2 3 4 5 6 7 M388 bp411 bp图3转化烟草幼苗的检测Fig.3 Electrophoresis testing of PCR amplification afterseedling transformation注：1: W38 , 26 :转化烟草幼苗，7: pART27-FR , M :DNA分子量标准 Mar

27、ker I (北京全式金公司)参考文献1 中国农业科学院烟草研究所.中国烟草栽培学M.上海：上海科学技术岀版社，2005.2 陈德鑫，王凤龙，杨清林，等.烟草抑芽剂及其使用方 法J.烟草科技，2003 (6): 46-48.3 Schumacher K, Schmitt T, Rossberg M, et al. The Lateral suppressor (Ls) gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein familyJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 290-295.4 Greb

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29、DPK基因家族的研究D.北 京：中国农业科学院研究生院，2009.7 Wesley S V, Helliwell C A, Smith N A, et al. Constructdesign for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plantsJ. Plant J, 2001,27: 581-590.8 Ellis J G, Llewllyn D J, Dennis E S, et al. Maize Adh-1promoter sequences control anaerobic regulation:

30、addition of upstream promoter elements from constitutive genes is necessary for expression in tobaccoJ. EMBO J, 1987, 6: 11-16.9 曾晓珊，戴良英，刘雄伦，等.dsRNA介导植物基因沉 默及其应用J.生命科学，2007，19 (2): 132-138.10 杨迎伍，李正国，宋红丽，等 .VIGS技术在植物基因功能研究中的应用J.植物生理学通讯，2007,43(2): 379-38311 刁文一，蒋建雄，熊兴华，等.RNAi在植物功能基因组中的应用J.现代生物医学进展，2

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