FFPE样品DNA提取SOP

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1、FFPE样品DNA提取SOP一、目的使用QIAamp-DNA-FFPE-Tissue-Kit提取FFPE样品中的DNA并纯化，得到合格的DNA片段，为后续实验做准备。二、背景介绍从FFPE样品中直接提取DNA是很困难的，在进行福尔马林固定时，生物分子彼此进行交联，故这些交联必须断裂，才能释放出DNA用于后续纯化。同时FFPE样品的珍贵性导致没有大量的材料可用于分析物纯化和下游分析，因此纯化步骤必须是高效的。三、技术特点QIAamp-DNA-FFPE-Tissue-Kit提供了一个克服交联的有效方法，并不需要过夜培养。此试剂盒是特别为FFPE样品的基因组DNA纯化而设计的。样品先用蛋白酶K在56

2、C处理1小时，这一步通过消化交联蛋白而释放DNA。接着是优化缓冲液中的90C孵育，这可使部分逆转交联：在孵育过程中，氨基之间的亚甲基桥断裂。四、试剂储存1. QIAamp吸附柱应储存在28C，短时间（一个星期内）使用的可以储存在室温中2.缓冲液储存在室温中（1525C）3.蛋白酶K可储存在室温中，若时间较长或室温超过25就需储存在28C中五、自备试剂和仪器耗材二甲苯乙醇（96-100%）1.5ml和2.0ml离心管移液吸头（为避免交叉污染，最好使用带滤芯的的吸头）带孔泡沫浮漂双孔的水浴锅或加热轨道的孵化器涡漩震荡仪小型高速离心机Qubit荧光计六、安全细则1.二甲苯是有毒试剂，进行实验时带好防

3、护用品，并在生物安全柜中进行操作。2. Buffer AL 和 Buffer AW1中含有盐酸胍，可以溶解蛋白质，导致细胞结构破坏。（如果包含这个缓冲液溢出的液体，用合适的实验室洗涤剂和水清洁。如果洒出的液体包含潜在的授课：XXX传染性病原体，清洁受灾地区先用实验室的洗涤剂和水，然后用1%(v / v)次氯酸钠）3.遗弃的废液和枪头要用专用的容器收集，集中处理4.固定操作区域，避免造成环境污染或样品串染七、操作指南1.试剂盒组成名称数量QIAamp吸附柱50个吸附柱收集管（2ml）3*50个Buffer ATL14mlBuffer AL12mlBuffer AW1 (浓缩)19mlBuffer

4、 AW2 (浓缩)13mlBuffer ATE20ml蛋白酶 K1.25ml2.实验流程授课：XXX清除石蜡裂解加热DNA吸附洗去杂质洗脱FFPE样品可使用的DNA石蜡溶解在二甲苯中使用蛋白酶K进行DNA释放90孵化逆转分子交联DNA结合到吸附柱的膜上洗去残留的污染物将DNA从膜上洗脱下来3.实验试剂的准备3.1.检查QIAamp DNA FFPE Tissue Kit缓冲液检查Buffer ATL及Buffer AL原液是否有沉淀物形成。有沉淀形成时，须升温至70同时适度晃动，使沉淀物全部溶解。3.2.配置Buffer AW1 在19ml Buffer AW1原液中加入25ml(96-100

5、%)无水乙醇，盖紧瓶盖并摇匀。在试剂瓶上作已加入无水乙醇的标记，同时须标注配置时间。配置好的溶液可在室温(15-20)下保存一年。 3.3. 配置Buffer AW2 在13ml Buffer AW2原液中加入30ml(96-100%)无水乙醇，盖紧瓶盖并摇匀。在试剂瓶上作已加入无水乙醇的标记，同时须标注配置时间。配置好的溶液可在室温(15-20)下保存一年。授课：XXX4.实验步骤1. 先将水浴锅一侧开启，并预热到56，为后续裂解准备。2. 从送检的FFPE样品中选取8张10m厚和250 mm2的石蜡组织切片，同时取相同数量的1.5ml离心管，并在管盖上做好对应的标记。3. 将选取的石蜡组织

6、切片置入已做好标记的1.5ml离心管中，加入1ml二甲苯。盖紧盖子并使用涡漩振荡器充分振荡10s。 4. 使用小型高速离心机在16000rpm离心2min。实验全程须保持在室温状态下进行(1525C)。 5. 离心结束后，使用移液器吸取并遗弃上部已溶解石蜡的二甲苯溶液，操作中应注意不要吸取到下方的组织。 6. 加入1ml 96100%无水乙醇，再次涡漩振荡器充分振荡。目的是用乙醇充分溶解组织中残留的二甲苯。 7. 在室温下使用小型高速离心机在16000rpm离心2min。 8. 先使用大量程的移液器吸取并遗弃大部分已溶解二甲苯的酒精溶液（吸取时要缓慢），然后使用细小的移液器头并应注意不要吸取到

7、下方荡洗后的组织。 9. 在室温下打开离心管盖子，静置10min至所有残余酒精全部挥发。10. 加入180l buffer ATL及20l 蛋白酶K，涡旋振荡器充分振荡。 11. 封口膜封闭已加入试剂的离心管，分别将其插入浮漂并置于预先已升温至56C的水浴锅中。孵育一小时，至组织完全裂解完毕。 12. 预先加热另一侧水浴锅至90C，1h后将56C水浴锅中组织已完全裂解的样本取出置于90C水浴锅中，孵育1h。注意应严格控制温度以及孵育时间，过高的温度以及过长的时间可能损害最终所提取DNA的完整。过短时间和较低温度则可能造成福尔马林解铰联不彻底，DNA提取总量降低。 13. 1h后将标本取出用纸吸

8、掉管外部的水，然后瞬时离心，将离心管盖子以及侧壁的液体甩入瓶中。待标本冷却至室温。14. 在每个样本中加入200l buffer AL以及200l无水乙醇，并立即涡旋振荡充分混匀，形成均一的组织溶液。如果样品数量较多，可以先进行缓冲液和无水乙醇预混。同时也可能产生部分白色不溶沉淀，但不影响后期DNA提取。 15. 再次瞬时离心，将离心管盖子以及侧壁的液体甩入瓶中。 16. 将包装内的QIAamp吸附柱取出并按照标本次序做好对应的标记。仔细的将1.5ml离心管授课：XXX中全部悬液移至QIAamp吸附柱中，操作过程中需注意要将所有液体全部转入吸附柱中，勿浸湿吸附柱与收集管边缘或遗留部分悬液。80

9、00 rpm离心2min，之后将下方收集管中的滤过液以及收集管一并遗弃。从离心机中取出QIAamp吸附柱动作要小心，操作过程中注意防止下方滤过液回流。如果离心2min后仍有部分溶液存在于上方过滤柱内，须采用更高的离心速度以及更长的离心时间再次离心直至过滤柱中完全排空。17. 将离心完毕的吸附柱置于新的收集管中，小心打开盛放样品的吸附柱盖子，分别加入500l AW1，注意加入洗液时勿浸湿吸附柱与收集管边缘。盖好盖子后8000 rpm离心1min，离心完毕后将下方收集管中的滤过液以及收集管一并遗弃。操作过程中注意防止下方滤过液回流。如果离心1min后仍有部分溶液存在于上方过滤柱内，须采用更高的离心

10、速度以及更长的离心时间再次离心直至过滤柱中完全排空。 18. 将离心完毕的吸附柱置于新的收集管中，小心打开盛放样品的吸附柱盖子，分别加入500l AW2，注意加入洗液时勿浸湿吸附柱与收集管边缘。盖好盖子后8000 rpm离心1min，离心完毕后将下方收集管中的滤过液以及收集管一并遗弃。操作过程中注意防止下方滤过液回流。如果离心1min后仍有部分溶液存在于上方过滤柱内，须采用更高的离心速度以及更长的离心时间再次离心直至过滤柱中完全排空。 19. 将离心机调至16,000 rpm，离心3min，甩尽吸附柱内残存的酒精。 20. 重新准备对应标记好的1.5ml 离心管，将离心完毕的吸附柱放置于离心管

11、中，并丢弃下方的废液收集管。注意整个过程保持动作平稳，防止下方滤过液回流污染吸附柱。小心打开吸附柱盖子，加入45l buffer ATE。操作时应注意将ATE直接滴加至吸附膜中央（不要让枪头触碰到膜），同时应保证ATE为室温以保证其溶解效率。最终洗脱体积将少于总加入ATE总量。 21. 盖好管盖并静置至少5min，之后将离心机调至16,000 rpm离心1min，将吸附柱遗弃，注意操作过程保持动作平稳，防止DNA溶液回流到吸附柱上，造成溶液损失。 22. 将离心得到的DNA溶液用Qubit荧光计检测DNA质量及浓度，并做好记录。 23. 将检测合格的DNA保存于-20C冰箱。八、故障排除 洗脱液中DNA浓度低1.样品溶解不足蛋白酶K存储温度过高样品包埋时未彻底脱水，残余的福尔马林抑制蛋白酶K活性授课：XXX2.无水乙醇纯度不够瓶盖长期没盖严，挥发部分使用变性乙醇，含有其他物质（甲醇或甲乙酮）3. 缓冲液 AW1、AW2无水乙醇添加不正确添加的无水乙醇纯度不够或者添加时读数方式不正确授课：XXX修订记录版本修改内容概述修订人生效日期 （注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!） 授课：XXX