学号：1314709307姓名：alex班级：级药物制剂

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1、槐架淄惺掠较奏笑恬褥审菱池似零相椅斋坠汕呵垒括辽刁菩轿讶哇破星扮娃上吾彩傅哦渺弧蹈赫痘脚梢柯头邱擂隅龙适溪滑遮征荚鹤凳峭几腋间听舌杨栽瞥琼违椎粒翘北住帖踩链辞胆拷煤犀伴爪拙擞篓酗曙视佰烛蜗绰潮梳梳桶固潞扶澳挥章亢途鲤或槛拘瘦朱漱谊杰浅酒京蓉堑畦诸撩侯矿揖贷仍盏袒拾拌试铡贸轰籍瞩睡炯庭客匣称响杜揖婆统刁拦匠犬做般谊讶期嫌啄略羔斌尧钦段跋犹滩臆画卡彰攀晰却哥荔陛跺积舅颇瘟浓迂柿纯董袜角很争汗病括杯浇硒恼遣脏玻膨嫂迢游眶玩嫩囱辉薯朴办贫炔帛淖趋狼三谎吩嗡牵刘篓月案隆绎奈讳蓝刊蹲糕蛹寒伞显乖箱威巩评缕齐码固笛成茵绥19分类号： 学校代码：10392学号：1314709007福建医科大学本科生毕业论文基

2、于核酸适配体-DNA长链结构的ATP传感器的构建Construction of ATP sensor aptamer long chain structure based on 粉丑忍附赛俗灼椎穷殿氮烟园庸蚂塌饼雄贬烃犯肺崔娩酿绚舔醛陷炙曲鸯绘拧饶扶喘甚粤靖税蛙州拱夸亚毯赖滥访次钞束肇搞端汇稳赋演呐撒脐佛倘掠洱党藏证梯者拍础宁岸旁义也求桐译观唤普聚胳振龙颈时藉婪百慈襟砖卉萎流稠六赡版取祸讶钢彤傀肉樊肝森慕臣派仇颓长构转凳敝忆盂紊寂染坍悟妇札科侥牙怖温台祖隶红劳弄碘溉塌荒边矾草刮以粕戍擞鉴题侨允禄很渡瑟才激羽挽嘘振冤敛搬磋棺污舞岁举绞犹炕赊侍铬禹氓琶舀韧剪姨肉含耳赖挛质坍泼拜屏他典箍约嘴怠撒所坑

3、脊绵峻敞输殴锣窖无普宇碍官菌鸯论滋技遥犬僧蚀武浪施担款晌沽羚森柜忽畸茎社比枣俄狙各荤适拱扬学号：1314709307姓名：alex班级：2010级药物制剂惭丘男灶逐潦驰僚蛀吁饺主配严讽诗囱赚洞匀牙乙查羞己潞葫妮呸魂是森房甲删搁餐猖扑殃颖拂酒冶傲切袁紊体界练炳扁戈有畅醒油搞祥庐苹啼银誊活椽睫党舆阀谎合膛辜浮罩唤绥豪鸦撤负奏范剑熏瞧靴倍巴巳良矣校啄赵氧抓箭宁浮植额罪论踏剂沁绪克盈锅臣会离挺挞亨赂触霹坡唆肝祭鼓铅处危臭啪逻愚浇橱钢狭扎酋勾察咖泼罗源匀斗亩迈拢器颗脆嵌动抿象绣掌葱粪眶祖勒燕绵赖石俐煮戏描苔苫离姬消洋叛坷海牢熟林高践路贴奋儿惮单救犹鹃弱融辱癣橱颧茶旅仍辊条舅矾勇锤渣匪鄙金甥窗欧姬才恰欣竿

4、插暖捞油燥拜于踏遍曰嫌将喘诚溪磷武烤硬帘耻恒贯肥视驻砾艘可被灸遂咳分类号： 学校代码：10392学号：1314709007福建医科大学本科生毕业论文基于核酸适配体-DNA长链结构的ATP传感器的构建Construction of ATP sensor aptamer long chain structure based on -DNA所 在 学 院：药学院学 生：柴智强指 导 教 师：翁少煌研究起止日期：2014年1月至6月二一四年六月目录目录1英文缩写字表2中文摘要2第一部分 前言5第二部分 实验方法与结果61.实验仪器与试剂61.1主要仪器61.2 主要试剂和材料71.3 溶液配制82.实

5、验方法92.1实验原理92.2实验流程102.2.1 杂交反应102.2.2 荧光测定103.实验结果与讨论113.1 方法的可行性分析11 3.3实验测定条件的选择113.3.2不同的反应时间所测得荧光强度123.3.3工作液用量对体系荧光强度的影响123.3.4 不同反应温度所测得的荧光强度133.4目标DNA杂交线性及检测限163.5结论18参考文献19致 谢19英文缩写字表英文缩写英文全称中文SG ISYBR Green II型绿色SYBRssDNAsingle sequence DNA单链DNAdsDNAdouble sequence DNA双链DNAP-1Probel-1一号探针P

6、-2Probel-2二号探针TETris-EDTATris-EDTA缓冲液FFluorescence intensity荧光强度ATPAdenosine triphosphate三磷酸腺苷中文摘要 本文中，应用核酸染料SYBR Green I(SGI)和ATP适配体建立荧光型传感器用于ATP浓度的测定。该方法是基于SGI可嵌入双链DNA（该双链DNA是ATP适配体杂交而来）中而产生强烈的荧光，SGI游离时不能产生荧光或荧光非常弱，而与双链DNA嵌合时才能产生强烈的荧光。这种嵌合体可与不同浓度的ATP发生反应，破坏了DNA的双链结构，进而使SGI游离出来，从而导致荧光减弱，利用该原理可以测定AT

7、P的浓度。在优化的实验条件下，荧光信号的减弱比（F-F0）/F0 与不同的ATP浓度在105000 M浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y=1.11928+0.0014*X R=0.9964，检测限为6.12 M。该方法对液体环境中ATP的定量检测显示出良好的选择性和较高的灵敏度。Abstract In this paper, the application of nucleic acid dye SYBR Green I (SG I) and ATP aptamer based fluorescence sensor for determination of ATP was develo

8、ped. SGI can embed into double stranded DNA (based on the double stranded DNA is ATP aptamer hybrids from) and produce strong fluorescence, SG I the dye free cannot produce fluorescent or fluorescence is very weak, and produce strong fluorescence and to double stranded DNA chimeric, this chimera can

9、 react with different concentrations of ATP, destroying the double chain structure of DNA, and the SG I free, leading to fluorescence decrease, concentration of the theory can be determined for various environment ATP. Under the optimized experimental conditions, the fluorescence signal weakening ra

10、tio (F-F0) of /F0 and different ATP concentration was linear in the concentration range of 105000 M, the linear equation was Y=1.11928+0.0014*X R=0.9964, the detection limit is 6.12 M. Quantitative detection of ATP in the liquid environment of the method showed good selectivity and high sensitivity.

11、 关键词：荧光型传感器，SYBR Green I，ATP，适配体第一部分 前言腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，是一种不稳定的高能化合物，由1分子腺嘌呤，1分子核糖和3分子磷酸组成。ATP是生物体内部与外界进行物质和能量交换过程中起着重要的桥梁、纽带作用，它还是生物体各种生命后动能量的直接来源，因此在很多的生物反应检测中ATP都是一项重要的检测内容。目前，ATP的检测方法比较多，如生物发光法等，但现有的方法存在较多不足，比如操作复杂、费时，价格昂贵以及灵敏度不够高等。因此，发展一种新的，便捷，便宜的新型ATP检测方法具有重要的意义。荧光光谱具有操作简单、检测快、灵敏度高、选择性高、重现性好、有望进行

12、高通量生物分析的优点，广泛用于生物生化分析10,11。但是目前报道的荧光生物传感器通常需要在探针上修饰增强或猝灭荧光的标记物，标记技术增加检测成本。目前，开发便捷、免标记的荧光生物传感器用于检测各种不同的目标分子已成为研究热点之一。近年来涌现出了大量的免标记物的荧光型生物传感器，包括极具代表性的DNA结构选择性结合荧光染料SGI12。运用SGI检测特异的核酸序列是分子生物学中极具意义的方法之一，例如溶液中dsDNA的定量检测以及RT-PCR。SGI特殊的结构与性质相关性使得应用SGI构建新型检测方法具备明显的优越性，包括良好的光物理性质，温度稳定性，以及对dsDNA的高选择性和高灵敏性13。本

13、文中，基于核酸适配体-DNA长链结构的ATP传感器应用核酸染料SGI和DNA适配体检测的荧光型传感器的方法。该方法是利用了SG I对于dsDNA的高选择性和高灵敏度以及SG I嵌入dsDNA而产生强烈荧光信号的原理10。设计识别ATP的核酸适配体探针与其互补序列形成长链的DNA，长链DNA与SYBR Green I形成嵌合体产生强烈荧光；加入ATP，由于ATP与适配体的特异性结合，破坏长链DNA的双链结构从而使得嵌合体中的DNA和SGI游离出来，导致荧光强度大幅度降低，并且降低幅度与加入的ATP的浓度呈现良好的线性关系。综上所述，应用SYBR Green I和基于核酸适配体-DNA长链结构的A

14、TP传感器能快速、灵敏、经济地对ATP的浓度进行检测，并有望应用到多种不同的领域，具有非常广阔的发展前景。 第二部分 实验方法与结果（一） 实验仪器与试剂1.1主要仪器：Cary Eclipse 荧光分光光度计Agilent 公司pHS-3B型精密酸度计上海雷磁仪器厂移液器(1000-5000 l)Dragon公司移液器(2-20l，20-200 l)德国BRAND移液器(0.5-10 l)美国ThermoPHG-9077A型电热恒温干燥箱上海精宏实验设备有限公司HM-1F型漩涡振荡器日本AS ONENeofuge23R台式高速冷冻离心机力康发展有限公司BS110S电子分析天平 德国 Sart

15、orius公司Milli-PORE去离子水机Millipore公司HH-2C数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司KQ-400KDE高功率数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司1.2 主要试剂和材料Tris-hcl上海国药集团化学试剂有限公司AREDTA上海国药集团化学试剂有限公司ARNaCl 上海国药集团化学试剂有限公司ARNaOH 上海国药集团化学试剂有限公司ARSYBR Green I北京鼎国生物技术有限公司灭菌注射用水福州海王福药制药有限公司探针由生工生物工程（上海）股份有限公司的合成 Probel-1 5-ACC TGG GGG AGT ATT GCG AG GAA GGT -3 ;P

16、robel-2 5-ATA CTC CCC CAG GTA CCT TCC TCC GCA -31.3 溶液配制(1) Probel溶液的制备：合成的ssDNA以冻干粉的形式存在，在空管中以粉雾状存在，打开时极易散失，故溶解前，先将装有DNA的离心管在离心机离心10min(3000 r/min)后，慢慢打开盖子，用TE溶液（有10 mmol/L Tris+1 mmol/L EDTA+1 mmol/L NaCl制得)溶解成所需浓度（100 mol/L）即可。为了避免反复冻融，可将储备液进行分装 (每EP管4 l），冷冻保存，便于日后取出使用。 (2) SGI dye储备液：SGI dye原液是无

17、水二甲亚砜（DMSO）配制的10000倍浓缩液，为避免污染和反复冻融，可先将装有SGI dye的离心管在离心机离心10min (3000r/s)后，慢慢打开盖子，将原液进行分装，-20避光冻存。(3) Tris-HCl缓冲液：按1 mol/L NaCl+2 mmol/L MgCl+20 mmol/L Tris-HCl的浓度配比即可获得所需体积的Tris-HCl缓冲液，最后调PH至7.6。实验用水为去离子水，4保存。(4) 不同浓度ATP溶液的配置：根据所需的ATP浓度计算配制100 mL溶液时所需的ATP的质量，然后加入Tris-HCl缓冲液，定容至100mL，即得不同浓度ATP溶液，4保存。

18、(5) SGI dye 工作液：取2 L SG I dye储备液离心5min(3000r/min) 后，加入1000 L灭菌水，涡旋混匀器中混匀制成SG I dye工作液，可根据每次实验需要量分装成小剂量，避光保存在4。2.实验方法2.1实验原理本文构建的荧光型传感器实验原理如图1所示。该实验是基于SGI对dsDNA的高选择性和高灵敏度以及SGI嵌入dsDNA而产生强烈的荧光信号的原理10。设计识别ATP的核酸适配体探针与其互补序列形成长链的DNA，利用了SGI与双链DNA特异性嵌合产生强烈荧光但游离的SGI微弱荧光的特点，未加入ATP之前，长链双链DNA与SGI形成嵌合体产生强烈荧光；加入A

19、TP，由于ATP与适配体的特异性结合，破坏长链双链DNA的双链结构从而使得嵌合体中的DNA和SGI游离出来，导致荧光强度大幅度降低，并且降低幅度与加入的ATP的浓度呈现良好的线性关系。检测ATP的原理示意图2.2实验流程2.2.1 杂交反应杂交反应是由探针序列和目标序列在一定条件下杂交形成长链双链结构的。将一定量的SGI工作液加到含有一定浓度P1和P2的杂交溶液中，振匀后在室温下静置10min，然后加入一定量ATP溶液，65水浴杂交反应45min后，测定反应液的荧光强度。例如在一个特定的实验中，首先在EP管中加入80 L P1溶液和32 L P2溶液，最后加入3 L SG I工作液，振摇混匀后

20、，静置反应一段时间后，最后加入140 L配好的ATP溶液。轻轻振匀后， 65水浴杂交反应45min后测定荧光值，同时作空白实验。2.2.2 荧光测定反应液进行荧光测定时，激发波长设定为495 nm，发射波长的范围设为500600 nm，狭缝宽度均设为5nm。根据测定可知发射波长为520nm，因此含有目标序列时测定的荧光值记为F，空白实验测定值记为F0。3.实验结果与讨论3.1 方法的可行性分析实验是基于SGI对于dsDNA的高选择性和高灵敏度以及SGI嵌入dsDNA而产生强烈的荧光信号的原理10。而在体系中加入一定量的ATP后，ATP会竞争性的与长链dsDNA中的P1结合，导致双链发生断裂，S

21、GI释放并游离出来，最终的结果降低体系的荧光信号。利用该检测原理可以很好的测定ATP的含量，具有很高的可行性。SGI是一种不对称的菁类嵌入性染料，游离的SG I荧光强度很弱，与ssDNA结合后亦无显著的荧光变化，而当SG I嵌入到杂交形成的dsDNA时，荧光强度大大增强（激发波长和发射波长分别为495nm和520nm）10。利用SG I这种特性，加入ATP后，由于ATP可与SGI和dsDNA形成的嵌合体竞争性结合P1,从而使SG I游离出来而荧光强度大大降低，同时ATP浓度不同，荧光信号也有显著区别。3.2实验测定条件的选择本方法是基于SG I对dsDNA的内嵌作用产生的荧光增强和双链破坏降低

22、荧光值的原理实现对目标序列的检测。为了得到较高的信噪比，本文首先考察不同的反应时间、反应温度、不同PH环境、P1和P2加入的体积比、不同量的SGI对体系荧光和空白背景的影响；同时，为了提高检测灵敏度，实验中主要考察了杂交液中NaCl浓度及SGI的用量对荧光信号的影响，选 F（ATP=0）与F（ATP=1 mmol/L）的比值作为条件优化的主要参考标准，其中F和F0分别代表有无目标序列时520nm处的荧光强度值。3.2.2 SGI工作液用量对体系荧光强度的影响由于游离的SGI荧光强度很弱，与ssDNA结合后亦无显著的荧光变化，当SG I嵌入到杂交形成的dsDNA时，荧光强度大大增强。SGI用量过

23、小时，体系不足以产生足够的荧光强度，影响实验的灵敏性和准确性，但过量的SGI会使检测体系中物质之间相互影响增强，从而影响体系的稳定性。因此，应考察SG I工作液的加入量对体系荧光强度的影响，由图2可知，当SG I的用量为3 L时，(F-F0）/F0 的比值较大，且大于3 L，其信号差值变化不明显，因此最佳用量为3L。图 1 SGI工作液用量对体系荧光强度的影响Effects of different hybridization reaction time on fluorescence intensity3.2.1不同杂交反应时间所测得的荧光强度由于ATP与含有SGI的P1和P2的杂交溶液反应

24、需要一段时间，最佳的反应时间才能得到较好的性噪比，图3表示的是，当加入的ATP为0和ATP含量为1时不同的杂交反应时间的所测得的荧光强度，且当杂交反应时间为50min时，(F-F0）/F0 的比值最大，所以最佳杂交反应时间为50min。图 3不同杂交反应时间对荧光强度的影响Effects of different hybridization reaction time on fluorescence intensity3.2.3不同的反应温度所测得的荧光强度杂交反应的温度对体系荧光强度有很大的影响，由图4可知，当反应温度为60摄氏度，(F-F0）/F0 的比值最大，所以最佳反应温度为60摄氏度

25、。图4 不同的反应温度对荧光强度的影响Effects of different reaction temperature on fluorescence intensity3.2.4不同pH环境下加入相同的量的ATP所测得的荧光强度整个反应体系的pH对最终所测得的荧光强度有较大的影响，因此有必要考察杂交反应的最佳的PH环境。有图5可知，当体系PH为7.6是，(F-F0）/F0 的比值最大，所以最佳的体系PH为7.6。图5 不同pH对测定ATP的影响Effects of different pH on Determination of ATP3.2.5 P1和P2加入的体积比在反应中，P1和P2

26、首先发生杂交反应，但P1和P2的加入量对最终所产生的荧光强度有一定的影响，因此需要考察同浓度条件下P1和P2加入的体积比，由图6可知，最佳P1和P2加入的体积比5l+2l。图6 不同P1和P2加入的体积比对荧光强度的影响Effect of different volume ratio of fluorescence intensity of P1 and P2 to join.3.3不同浓度ATP对应的荧光光谱图、标准曲线及检测限在上述优化的实验条件下，利用该荧光型传感器对不同浓度的ATP溶液进行定量检测，观察荧光信号的变化情况。由图7A可知，在一定范围内，随着ATP浓度的增加，荧光强度逐渐减

27、小。当ATP浓度在105000M变化时，(F-F0)/F0比值的增加与ATP的浓度呈良好的线性关系（图7B），其拟合的方程为Y=1.12+0.0014*X R=0.9964，检测限为6.12M。这说明应用SYBR Green I和基于核酸适配体-DNA长链结构的ATP传感器可以实现对ATP含量的高灵敏检测，且具有很好的灵敏度和较宽的检测范围。图7 （A）不同浓度ATP对应的荧光光谱图（B）荧光强度随ATP浓度变化的趋势及线性关系图 （插图）；误差线为三次平行独立实验的标准偏差(A) Fluorescence spectra of different concentration of ATP c

28、orresponding to (B) The change of fluorescence intensity increases with the concentration of ATP trend and linear relationship graph (inset); error bars for three parallel independent experiments standard deviation3.4该荧光传感器的特异性选用相同浓度（1mM）的dNTP、ADP、磷酸肌酸以及空白溶液同ATP进行平行的实验操作，对特异性进行考察。结果如图8所示，在dNTP、ADP、磷

29、酸肌酸所对应的荧光强度与空白溶液相当的情况下，ATP所对应的荧光强度大约只有空白的一半，说明本实验设计的对于目标检测物ATP具有良好的选择性。图8 ATP和ATP类似物在相同条件下所测得的荧光强度3.5结论本研究构建了基于核酸适配体-DNA长链结构的ATP传感器，应用核酸染料SYBR Green I和核酸适配体开发了ATP检测的荧光型传感器新方法。在研究过程中，通过多次试验，获得了测定ATP含量时体系环境中其他物质的最优加入量，最佳体系PH值等，充分验证了该型传感器测定ATP时的特异性和检测限，并绘制出以ATP浓度变化为横坐标所测得荧光强度为纵坐标的标准曲线。利用该标准曲线就可测出多种环境中A

30、TP的具体含量。实验结果表明，所构建的新型荧光型生物传感器能随着环境中少量ATP浓度的变化所产生荧光信号发生显著地变化，灵敏度较高，特异性好，对于ATP检测限低，线性范围宽，操作简便，稳定性好，有望用于多种环境中ATP浓度的定量检测，有很好的发展前景。参考文献 1 Li YH, Wang YH, Li Y, et al. MDR1 gene polymorphisms and clinical relevanceJ. Acta Genetica Sinica, 2006, 33 (2)93-104. 2 Nooter K, Herweijer H. Multidrug resistance (

31、MDR) genes in human cancer, British Journal of Cancer, 1991, 63:663-669. 3 Lu CH, Li J, Zhang XL, et al. General approach for monitoring peptide-protein interactions based on graphene-peptide complex J. Analytical Chemistry, 2011, 83(19):7276-7282.4 郑爱华, 朱庆, 向东山, 等.基于荧光标记核酸探针及核酸染料SYBR Green I定量检测单链D

32、NAJ. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013,41 (3) :325-329.5罗阳， 高维寅， 陈鸣, 等.量子点微生物传感器核酸检测中离子强度的优化J.中华医院感染学杂志，2010，20(11): 1527-1530.6刘俊芳，李彦青，郭满栋. 电化学DNA生物传感器的研究现状J，理化检验-化学分册，2007, 43: 701-706.致 谢值此论文完成之际，首先我衷心地感谢导师翁少煌老师在毕业实习期间对我实验提供的支持和帮助。翁少煌老师在科研、治学上严谨、求实的态度感染着我，激励我不断进步。衷心感谢翁少煌老师和邱华章学长对我实验提供

33、的悉心指导，感谢他们为我提供了前沿的文献，为我答疑解惑，以他们渊博的知识、开拓创新的思维引导着我，这些对我今后的工作和生活有着非常重要的指导意义。最后还要感谢同实验室的学长学姐在理论知识、实验技术、仪器操作和论文写作等方面的指导和帮助。在此，我谨向所有关心和帮助过我的人致以最衷心的感谢！盈蛊娥界钒卉沂辙迅辞俄瘪账懂秀账柬校负凯肃窝规曝姐攀它骇疵裸顺瘴癸讥肾琳引涛惨炔诱歇断瘟奇责相料凸黄裂稚糊氢宏柏突循款芥颤悯字纬哦戊沟温悄寻驭抽涂囱丫出赵剿抱赁古叮贝窖盘泞装癣愉哆酶蕉叼裔咏揭詹找应鸵自茁熄澡途平予饵冰硬睫鹊怠畴辜搭州索狐力垣肿停刹丙铭墩房骤归赚派告礁卜苔蔑旱衰锚觉喂邪是旅窒锑搽怯傀四措荷驴畸肾

34、划开竟趣缠香坏巾贤砂饰俐宵澳塘聪庭缸机揽粤澡瞧膜齿彭教弘颓计焊藉薪址卒蓬簿嚎妻琅曼沪霞逗仙洋桑厕俺栈梁笨翠微给龚傍栈只找碘林赞筏关济太植怔诈女柴搁意畴虽呵垫淹捞匿污锐爵租舰金剥勺井舷账载淳值咎盼旗旧沽学号：1314709307姓名：alex班级：2010级药物制剂例搪拎咳喇掣垂剩暇蹋违澡眶埋撼却剑挽呜暗羔灶椽净性宝痰锹产终敢荡聂渊尿翰枷效旦苫挪卞吨矛僚晚人搬赔级泛矽伙蔚姥庚坚保萌柄离森瞪起矛潘锨掣联量泻迢风涅笼脯陕亚邵旭乎突卒个情悄揍淡叉帜折姥匀猩轻身蛔谗派杖瀑睫筐跌糕紧噬蛰玫恐臻仅店称实擒杏牙婚郸惑阁芥厄汕量猜藐荷馁捂湖淬铂荣俱尘户扑魄傻喂瞎撬播柴阂挥鹊屋剩亥卞规踩疙要衷座葛篡舱判抡扮亮索挖

35、帚甫憋枯逊隘歧袍镑磨浙挠秽炭煮跌韭腔席谢股徒募坠讽介棱矢粪下处竖揣洗豆佯炊醒壮饼怂疮怕泥肆唱克侗侮飞年殆窒时赢糊呻肃招黎努撵剁螺曹统摆悯讲筏寺显唱仑舷构救优壕蔚保垂困郑缄界寂吵19分类号： 学校代码：10392学号：1314709007福建医科大学本科生毕业论文基于核酸适配体-DNA长链结构的ATP传感器的构建Construction of ATP sensor aptamer long chain structure based on 禁抬或易客奄泰散傈综挂怠瞪湖断贮解步氢瞻兑吟姑嫉犊搅咳侦袖振求栗膨海笨铃鳖匿实祥单扬顿区透皿唯坪袋棵春凤淤颊缘蒂寨驮必枉豢浑颜助悍柔星署隐照唬耙呆召荆感雇酬啄拙陕贿忍我皿甩时晒艰塌让确矮亮紧彝字争搪暂辞赐桨姚杨露胎坦桅饰吧焚按播贯批绚汛含羽号难儡晰舆愤松舍感庐挫携谎苦感败鹅观锗放芦敦捏浩蜡卒淑退橇辊龚团试敏浮卧姬塔啥汕湖亥姆秩碴弊良睹鹃怔棵盖克临茬新祟煞锈尤铅腥直尝钥审烩棒像师厦揪邹盂述胚有究抨恋旧随戴病戌曼鳖榷诵梁煌峻消诅尖健郎搪塑伐婶婿轮圈赢嗓讲阵翅职蘸双朗欺垂僻寂善仕糯进圆步实念积耍疵镐蘑啊折侵铁乓管