生物分离工程：发酵液的预处理及细胞破碎

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1、常规的分离方法： 重力沉降 离心沉降 过 滤生物细胞分离的主要手段生物细胞分离的主要手段 gdus)(182球形粒子Stokes匀速沉降方程：细胞悬浮液：包含生物细胞、水、细胞代谢物、未消细胞悬浮液：包含生物细胞、水、细胞代谢物、未消 耗的培养基以及少量的细胞碎片。耗的培养基以及少量的细胞碎片。 细胞悬浮液能否实现理想的分离效果取决于细胞细胞悬浮液能否实现理想的分离效果取决于细胞的种类及表面特性、分泌物的性能等，因为这些特性的种类及表面特性、分泌物的性能等，因为这些特性决定了细胞在发酵液中的状态、即是自由状态还是絮决定了细胞在发酵液中的状态、即是自由状态还是絮凝状态以及悬浮液的黏度等。凝状态以

2、及悬浮液的黏度等。 发酵液的黏度、细胞的大小、状态决定了固发酵液的黏度、细胞的大小、状态决定了固- -液液分离采用的方式、设备。分离采用的方式、设备。 工业生物技术中微生物的大小工业生物技术中微生物的大小 在细胞回收中细胞和聚集物重要性质在细胞回收中细胞和聚集物重要性质悬浮液分离时存在的问题：（1 1）细胞和培养液密度相近，采用离心法处理时，）细胞和培养液密度相近，采用离心法处理时，需要的离心力较大，离心时间长需要的离心力较大，离心时间长；（2 2）细胞具有可压缩性，悬浮液黏度高导致过）细胞具有可压缩性，悬浮液黏度高导致过 滤阻力大、滤布容易堵塞；滤阻力大、滤布容易堵塞； 为了降低发酵液的黏度

3、、增大细胞聚集度及为了降低发酵液的黏度、增大细胞聚集度及降低其亲水性，降低分离的难度和成本，对细胞降低其亲水性，降低分离的难度和成本，对细胞悬浮液进行预处理是非常必要的。悬浮液进行预处理是非常必要的。1. 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率；2.去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操作。（1 1）加热法加热法。适用于热稳定性的目标产物适用于热稳定性的目标产物（2 2）调节溶液的）调节溶液的pHpH值值。主要是增加细胞的聚集程主要是增加细胞的聚集程 度，一般用无机酸或碱来调节度，一般用无机酸或碱来调节 这两种方法都能使液体黏度降低，过滤速度加快。如生产链

4、霉素的悬浮液预处理时，调pH 3.0左右，加热至70C，维持半小时以凝固蛋白质，这样可使悬浮液黏度降低至最初的1/6，过滤速度增大10-100倍。（3）加入凝聚剂和絮凝剂）加入凝聚剂和絮凝剂l凝聚与絮凝其处理过程就是将化学药剂预先投凝聚与絮凝其处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。集成可分离的絮凝体，再进行分离。凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐

5、类或石：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类或石 灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚 集成集成mmmm 大小块状凝聚体的过程。大小块状凝聚体的过程。絮凝：絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量 聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成 10 mm10 mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要 起架桥作用。起架桥作用。凝聚和絮凝 凝聚和絮凝在预处理中常用于细胞、菌体（胞外产物）、细胞碎片（胞内产物）以及蛋白质等胶体粒子的去除。凝聚剂：铝、铁的盐类或石灰石等可水解的无机

6、盐 类电解质。作用机理： 利用带电分子对细胞表面电荷的中和,消除双电荷层而脱稳，或是通过形成氢键等方式与细胞作用产生凝聚，主要目的是降低细胞表面与水的相互作用。 反离子的化合价越高，反离子的化合价越高，凝聚值就越小凝聚值就越小凝聚能力凝聚能力越强。越强。阳离子对带负电的胶粒凝聚能力的次序为：阳离子对带负电的胶粒凝聚能力的次序为： Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+常用的凝聚剂有：常用的凝聚剂有： Al2(SO4)318H2O （明矾）；（明矾）； AlCl3 6H2O； FeCl3; ZnSO4; MgCO3等等絮凝作用：利用含有多个功能基团的线状高分子絮凝作用

7、：利用含有多个功能基团的线状高分子 聚合物的架桥作用使细胞发生絮凝而聚合物的架桥作用使细胞发生絮凝而 变成粗大的絮凝团。絮凝剂的浓度、变成粗大的絮凝团。絮凝剂的浓度、 悬浮液的酸度和离子强度都将影响絮悬浮液的酸度和离子强度都将影响絮 凝的效果。凝的效果。高分子絮凝剂的吸附架桥作用絮凝剂：絮凝剂：高分子的聚合物，必须长链线状的结构，高分子的聚合物，必须长链线状的结构， 易溶于水，其相对分子量可高达数万至易溶于水，其相对分子量可高达数万至 一千万以上。一千万以上。合成高聚物合成高聚物：分为阴离子、阳离子和非离子三大：分为阴离子、阳离子和非离子三大 类。如聚丙烯酰胺、聚乙烯酸钠、类。如聚丙烯酰胺、聚

8、乙烯酸钠、 聚二烯丙基四胺盐等。聚二烯丙基四胺盐等。 由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以以ppm计量，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速计量，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。度快以及种类多等优点，所以适用范围广。聚乙烯亚胺聚丙烯酰胺l天然高分子天然高分子 ：多聚糖类，如壳聚糖、海藻酸钠、：多聚糖类，如壳聚糖、海藻酸钠、明胶等；明胶等；l微生物絮凝剂：微生物絮凝剂：是近年来研究和开发的新型絮是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生物产生的具有絮凝细胞凝剂，它是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋

9、白、粘多糖、纤功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。点是安全，无毒和不污染环境。l无机高分子无机高分子：聚合铝盐和聚合铁盐等。：聚合铝盐和聚合铁盐等。分为两种形式：分为两种形式：离心沉降：利用固离心沉降：利用固-液两相的相对密度差，在离心机无孔液两相的相对密度差，在离心机无孔 转鼓或管子中进行悬浮液的分离操作。转鼓或管子中进行悬浮液的分离操作。离心过滤：利用离心力并通过过滤介质，在有孔转鼓离离心过滤：利用离

10、心力并通过过滤介质，在有孔转鼓离 心机中分离悬浮液的分离操作。心机中分离悬浮液的分离操作。优点：使用方便，可以实现对颗粒小或黏度大悬浮液的优点：使用方便，可以实现对颗粒小或黏度大悬浮液的 分离。分离。缺点：大规模使用价格昂贵。缺点：大规模使用价格昂贵。离心沉降离心沉降1、原理：悬浮液中的大多数细菌都可看成是直径为d的球形粒子根据Stocks定律其中 CD为阻滞系数，A为粒子在运动方向上的投影面积，u为运动速度。 CD的数值取决于雷诺数Re的变化。对于球形粒子，Re1， CD=24/Re FgFfgdgVFssg(6)(32213uACudFDfduRe对于生化溶质，可以满足Re1的要求，所以当

11、粒子匀速沉降时，Fg = Ff，故匀速沉降速率为如果粒子在离心场中沉降，则重力加速度g换成离心加速度2r，即：S为沉降系数，蛋白质的相对分子量越大， 沉降系数越大。)4)(21(Re24)4)(21(2222duduCFDfgdus)(182222)18Srr)(dusrNrFc2224grNZ224Fc离心力或离心加速度Z分离因素或离心强度 在科学文献中，常用离心力或离心强度来表征离心的操作条件 离心设备 Z越大，越有利于分离。常按分离因素Z的大小，对离心机进行分类。（1） Z 3000，为常速离心机（2） Z= 3000 5000，为中速离心机（3） Z 50000，为高速离心机（4） Z

12、= 2104 106， 为超高速离心机离心沉降设备瓶式离心机：实验室常用的离心机，低、中速；工业用无孔转鼓离心机（1）管式离心机：直径为40-150mm，长径比为48，离心强度可达 1500065000，处理能力为0.10.4m3/h, 适合分离的 固体粒子直径为0.01100m, 固液密度差大于 0.01g/cm3, 体积浓度小于1%的难分离悬浮液，常用 于微生物菌体和蛋白质的分离。（2）碟片式离心机：这是一种应用最为广泛的离心机。碟片式离心机的特点： 密闭转鼓内装有十至上百个锥顶角为60-100的碟片，碟片的间隙一般只有0.52.5mm, 固体颗粒的沉降距离极短，分离速度快、效果好。这类离

13、心机的离心强度可达300010000。根据卸渣的方式又可分为：A、 人工排渣碟片离心机：适用于固相浓度低的场合（1%-2%）B、喷嘴排渣碟片离心机：转鼓周围有2-24个喷嘴，排渣的含液量高，适用于浓缩过程，浓缩比可达520，最大处理量为300m3/h,适合分离的固体粒子为为0.1100m, 固液浓度小于25%的悬浮液。C、活门排渣碟片离心机：可连续排渣，不须停车。最大处理量为40m3/h,适合分离的固体粒子为为0.1500m,固液密度差大于0.01g/cm3, 固液浓度小于15%的悬浮液, 对一些难分离物质特别有效，因此应用范围是最广的。如大肠杆菌的分离等。原理：是以离心力为推动力的过滤过程。

14、兼有离心和过 滤的双重任务。 是化工过程中的传统操作，是目前生化分离中用于分离细胞和发酵液的主要方法。达西（Darcy)定律： K- Darcy定律的渗透度悬浮液滤液支承物滤饼滤布pUlpKU 假设滤饼为球形的多孔床层，则科泽尼（Kozeny)方程为)(FFlRlRpUcc)(2FVVWpAAUdtdV32)1 ( sSK使用惰性助滤剂改善过滤效果助滤剂：颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状 物质。 如硅藻土（水生植物的遗骸）、膨胀珍 珠岩（火山岩）、石棉、炉渣等；作用机理：增加滤饼的孔隙率、减小其不可压缩 性，降低过滤阻力，增加流速、降低 成本。使用方法：（1）在滤布上预涂一层助滤剂，待滤毕后

15、与滤 饼一起除去；（2）助滤剂按一定比例混入悬浮液中，降低其 可压缩性； 在生物工艺中应用较广并具有工业意义的过滤器主要有真空、压力过滤器两大类。（1）真空过滤器（a）转鼓真空过滤器 是用于大规模生物分离的主要过滤设备，可以分离较难过滤的悬浮固体粒子。能实现自动操作，故劳动强度小。问题：助滤剂消耗大，不能连续操作，仅限于低黏度的滤液使用。（b）圆盘真空过滤器水平圆盘过滤器：适用于对滤饼洗涤效果要求较高的场合。水平回转翻盘式真空式过滤器： 适用于过滤密度大、浓度高的粗颗粒悬浮液。 与转鼓过滤器相比，圆盘直径大，更易实现大型化。其最大过滤面积可达400m2第二节第二节 细胞破碎细胞破碎（cell

16、disruption) 细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜,使目标产物释放出来。其中，细胞壁的破碎最为关键。 细胞的破碎方法 在细胞破碎之前，要充分了解细胞的类型、细胞壁的结构以及目标产物的性质和存在的部位。只有这样才能选择合适的破碎方法，达到以下两个目的： 1 使目标产物最大量地释放到液相中； 2 尽可能减少杂质的量，以利于后续分离操作。 革兰氏阴性菌细胞壁结构 细胞壁肽聚糖层薄，仅细胞壁肽聚糖层薄，仅2 23nm3nm，占细胞壁成分的，占细胞壁成分的1010左右；左右； 由于肽聚糖之间仅由四由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故

17、层较疏松，位于肽桥，故层较疏松，位于细胞壁最内层，紧贴在细细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，胞膜上，在肽聚糖层外面在肽聚糖层外面还有一较厚的外壁层还有一较厚的外壁层( (约约8 81010nm)nm)。 革兰氏阳性菌的细胞壁结构细胞壁厚细胞壁厚有有202080nm80nm的肽的肽聚糖层，约占细聚糖层，约占细胞壁成分的胞壁成分的40409090含有大量磷壁酸含有大量磷壁酸酵母的细胞壁酵母的细胞壁主要存在三种聚合物，主要存在三种聚合物，葡聚糖葡聚糖、几丁质几丁质以及以及糖蛋白糖蛋白。最外层是。最外层是-和和-葡聚葡聚糖的混合物，第糖的混合物，第2 2层是糖蛋白的网状结构，葡层是糖蛋白的网状结构，葡聚糖

18、与糖蛋白结合起来，第聚糖与糖蛋白结合起来，第3 3层主要是蛋白质，层主要是蛋白质，最内层主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入最内层主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。以强度有所提高。 细胞壁的刚性、强度和保护细胞的作用主要来自其构成的主要成分肽聚糖。肽聚糖是N-乙酰胞壁酸和带有D-型或L-型氨基酸侧链的N-乙酰胞壁酸的多聚体。是高度交

19、联的分子。 破碎细菌的主要阻力是来自于破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的肽聚糖的网状结构网状结构，其网结构的致密程度和强度取决，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。程度，如果交联程度大，则网结构就致密。 1 1高压匀浆法高压匀浆法 高压匀浆法(Highpressure Homogenization) 所用设备是高压匀浆机，它由高压泵和匀浆阀组成，高压泵提供物料连续流动的动力，破碎主要在匀浆阀处完成。 高压匀浆的结构简示 1-细胞悬浮液； 2-加工后的细胞匀浆； 3-阀座； 4-碰撞环； 5

20、-阀杆 从高压室(几百个大气压)压出的细胞悬浮液(见图)经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的浆液又射到静止哗击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列过程中经历了高速造成的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化，从而造成细胞的破碎 。破碎动力学破碎动力学动力学方程： R 是单位生物量释放出的内含物量(mgg)， Rm 是R 的最大值；K为破碎速度常数，表示破碎的阻力；动力项P也可以表示成动能项：式中S为破碎率，其定义为 S=R/Rmax，为悬浮液的密度；为射流的速度(压力为15MPa时，流速高达190m/s)。abmmPKNRRR)/(lnabv

21、NKS)2/()1/(1ln2机械因素机械因素：阀与阀座的形状、二者之间的距离 操作因素操作因素：操作压力P和循环次数N，一般说来，增加压力或增加破碎次数都可以提高破碎率，但当压力增加到一定程度后对匀浆阀的磨损较大。 细胞细胞细胞壁的机械强度：细胞壁的机械强度：微生物的形态和生理状态决定了细胞的机械强度 。破碎参数(Rm 、K、b、P等)随微生物种类和培养条件的不同而有所差异。 目标产物在胞内的位置：目标产物在胞内的位置：胞内物质的释放快慢则由内 含物在胞内的位置决定。例如，胞间质的释出先于胞内质，而膜结合酶最难释放。 图 3-3 高压匀浆过程的蛋白质释放率 R 与匀浆次数 N 及压力 P 的

22、关系 Rm-最大蛋白释放量 研究表明蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起。如果能将温度控制在35以下，那么酶活损失可以忽略。对于温度敏感性物质，低温操作是必需的。高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却。尽管提高压力有利于细胞破碎，但是提高压力需增加能耗，同时为移走产生的热量需要付出代价。机械破碎的能耗主要包括提供动力(如压力)消耗的能量以及低温操作耗费的能量。 除较易造成堵塞的团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌以及质地坚硬的亚细胞器(如包含体，inclusion body)不适于用高压匀浆器处理以外，其它微生物细胞都可以用高压匀浆法破碎。 高速珠磨法(Highspeed b

23、ead mill)也是一种有效的细胞破碎方法。珠磨机是该法所用的设备，其结构示意图见下图。瑞士WAB公司和德国西门子机械公司均制造各种型号的珠磨机。 A-细胞悬浮液进口；B-微珠加入口；C-破碎细胞出口 D-冷却剂夹套；E-碟片；F-分隔碟片；G-动力分离器 微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂(通常是直径lmm的无铅玻璃珠)在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。 图3-4 水平搅拌式珠磨机的结构示意图 1-细胞悬浮液； 2-加工后的

24、细胞匀浆； 3-液珠分离器； 4-冷却液出口； 5-搅拌电机；6-冷却液进口； 7-搅拌浆； 8-玻璃珠影响因素：转速、进料速度、珠子直径与用量、细胞浓 度、冷却温度、破碎时间等。动力学方程 研究表明胞内蛋白的释放符合一级动力学:间歇操作： 1nRm(RmR)1n(D)t连续操作： 1nRm(RmR) (Vf)/f D(1十1j)j其中：k为破碎速率常数，与微球粒径、密度、填充率以 及细胞浓度、搅拌速度和搅拌浆的形状有关。 水平搅拌式珠磨机破碎酵母细胞过程的能耗E 与流速 F及浓度C的关系 C-细胞悬浮液浓度（W/W）； X-细胞破碎率 虚线代表 温控与能耗温控与能耗 珠磨机是采用夹套冷却的方

25、式实现温度控制的，一般情况下能够将温度控制在要求的范围内。珠磨破碎的能耗跟细胞破碎率成正比。提高破碎率，需要增加装珠量，或延长破碎时间，或提高转速，这些措施不仅导致电能消耗的增加，而且产生较多的热量，引起浆液温度升高，从而增加了制冷费，因此总能量消耗增加。实验表明，破碎率80，能耗大大提高。不仅如此，高破碎率还给后分离带来麻烦。对于可溶性胞内产物的提取，细胞破碎后必须进行固-液分离，将细胞碎片除去。尽管采用高速离心、错流微孔过滤或双水相萃取等技术可以除去碎片，但是破碎率越高、碎片越细小、清除碎片越困难，并且不得不考虑产物活性损失因此增加的可能性。总之，不管是高压匀浆还是珠磨破碎，都不是以破碎率

26、为基准，而是考虑产物的收率和兼顾上下游过程。 高压匀浆法同高速珠磨法相比各有特点：前者操作参数少，易于确定；后者操作参数多，一般凭经验估计，并且珠子之间的液体损失使一次处理85m1悬浮液最终只能得到50m1左右的浆液。连续操作时珠磨机兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，而高压匀浆器需配备换热器进行级间冷却；其次珠磨法破碎在适当条件下一次操作就能达到较高的破碎率，而高压匀浆往往需循环24次才行；再者几乎所有种类的微生物细胞都可以用珠磨机破碎，包括含有包含体的基因工程菌的破壁，质地坚硬的包含体可以大当研磨剂，更有利于细胞破壁，而包含体常常磨损高压匀浆阀。 l细胞悬浮液以喷雾状高速冻结形

27、成粒径小于50m的微粒子；l高速载气将其带入破碎室l高速撞击撞击板 使冻结的细胞破 碎。细胞量：1020%工业规模处理能力： 10L/h优点优点l适用于大多数微生物细胞和植物细胞适用于大多数微生物细胞和植物细胞l细胞破碎程度均匀细胞破碎程度均匀l可避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器的回可避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器的回收收 声频高于1520kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，其破碎机理尚未弄清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。空化现象是在强声波作用下，气泡形成、长大和破碎的现象。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关. 应用范围l杆

28、菌比球菌易破碎l革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌易破碎l对酵母菌和真菌的破碎效果较差应用前景：应用前景： 超声破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少。但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活，噪声令人难以忍受，而且大容量装置声能传递、散热均有困难，因而超声破碎的应用潜力有限。 某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂(SDS、 Triton X100)、金属螯合剂(EDTA)、变性剂 (盐酸胍，脲)等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。 作用机理(1) EDTA作为螯合剂，可用于处理革兰氏阴性

29、菌(如Ecoli)，对细胞外层膜有破坏作用。革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子将脱落，使外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，导致该区域通透性增强。(2)有机溶剂常用的是甲苯，它能溶解细胞膜的磷脂层。(3)Triton X100是非离子型表面活性剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，因此其作用部位主要是内膜的双磷脂层。Triton X100常与其它试剂混合使用。(4)盐酸胍和脲是常用的变性剂。一般认为胍能与水形成氢键作用,削弱了溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于

30、水溶液，如胍能从大肠杆菌膜碎片中溶解蛋白。应用应用 目前实验室应用较多的是用变性剂盐酸胍或脲处理Ecoli基因工程菌，渗透出重组蛋白来。盐酸胍不仅能改变细胞的通透性，而且能溶解不溶性重组蛋白(如包含体)，并在其它试剂的配合下使其二硫键断裂，变性解离成亚基，从而释放出来。除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下恢复肽链内或肽链间的二硫键，再折叠复性成具有活性的蛋白质立体结构。 根据各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理地搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。实验表明单独用0.1mol/L胍处理Ecoil仅释出约1的胞内蛋白，用0.5Triton X-100释放率为4。二者合用，在同样的时间内胞内蛋白释

31、放率达到53左右，同样的收率需要4 mol/L的胍。一般认为胍溶解了细胞外膜，使内膜暴露于Triton中，双磷脂层遭受损伤，结果大大改变了细胞的通透性。 与机械法的比较与机械法的比较 化学渗透法与机械法相比具有如下优点。 (1) 对产物释出具有一定的选择性：化学试剂处理能使一些分子量小的溶质(如多肽和小分子的酶蛋白)透过，而分子量大的物质(如核酸)则被阻滞在胞内。控制条件可以有选择地释出位于细胞内不同部位的产物，例如用02 mol/L胍处理 Ecoil，5h后80位于胞间质的内酰胺酶释放出来，而总的蛋白释放率仅为4。 (2) 细胞外形保持完整；碎片少，有利于后分离。 (3) 核酸释出量少，浆液

32、粘度低，便于进一步提取。 酶溶法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、1,3葡聚糖酶、l,6葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶)、壳多糖酶等， 细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。 溶菌酶主要对细菌类有作用，其它酶对酵母作用显著。 作用机理： 溶酶同其它酶一样具有高度的专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只对葡聚糖起作用，因此利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。 应用：应用： 用酶溶法剥离细胞壁，将原生质体进行融合，这是细胞工程常用的方法。使用溶酶系统时需注意控制温度、pH、酶用量及使用次序等。 存在的问题存在的

33、问题 在溶酶系统中，产物抑制是一个不容忽视的问题，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。产物抑制可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。目前酶溶法仅限于实验室规模应用，虽然酶溶法具有选择性释放产物、核酸泄出量少、细胞外形完整等优点，但是这种方法也存在明显的不足：一是溶酶价格高，限制了大规模利用，若回收溶酶以降低成本，则又增加了分离纯化溶酶的操作；二是酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，而且也不易确定最佳的溶解条件。 机械破碎法与非机械法的比较 比较项目 机 械 法 非机械法 破碎机理 切碎细胞 溶解局部壁膜 破片大小 碎片细小 细胞碎片较大 内含物释放 全 部 部 分 粘 度 高

34、(核酸多) 低(核酸少) 时间，效率 时间短，效率高 时间长，效率低 设 备 需专用设备 不需专用设备 通用性 强 差 经 济 成 本 低 成 本 高 应用范围 实验室，工业范围 实验室范围 1 1多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合 化学法与酶法取决于细胞膜壁的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法或酶法与机械法相结合的原理。 例一：机械破碎前预先用硫醇(thiol)培养酵母细胞，可以大大提高胞内蛋白的收率。原因是被硫醇激活的糖苷酶除去了细胞壁中的糖，使壁强度减弱。 例二：用Zymo1yase预处理面包酵母，然

35、后高压匀浆。95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100，而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32。 2 2与上游过程相结合与上游过程相结合 在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数(如pH值、温度、通气量、稀释率)等因素细胞破碎都有影响，因此细胞破碎与上游培养有关。另一方面用基因工程的方法对菌种进行改造也是非常重要的，这方面的工作包括以下几方面。 (1) 包含体的形成。包含体是重组蛋白在原核生物细胞内表达后形成的不溶性组分，细胞破碎后包含体可用密度梯度离心收集，再将其变性溶解，透析除去变性剂，蛋白质折叠复性。当然也可用化学渗透法处理含有包含体的宿主细胞(Ecoli)。 (2) 克隆噬菌体溶解基因。在细胞内引进噬菌体基因，控制一定条件(如温度)，细胞自内向外溶解，释放出内含物。 (3) 耐高温产品的基因表达。在破碎和分离过程中，为防止产品失活而消耗的制冷费是相当可观的。如果产品能表达成耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么在较高的温度下就可以将产品与杂质分开，这样既节省了冷却费用，又简化了分离步骤。 3 3与下游过程相结合与下游过程相结合 细胞破碎与固液分离紧密相关，对于可溶性产品来讲，碎片必须除净，否则将造成层析柱和和超滤膜的堵塞，缩短设备的寿命。因此必须从后分离过程的整体角度来看待细胞破碎操作，机械破碎操作尤其如此。