草果GCMS指纹图谱研究

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1、2015年度本科生毕业论文（设计）草果GC-MS指纹图谱研究 院 系： 理学院 化学系 专 业： 化学专业 年 级： 2011级 学生姓名： 何宣鹏 学 号： 201101020132 导师及职称： 吴娜（讲师） 2015年4月2015Annual Graduation Thesis (Project) of the College Undergraduate Study on GC-MS fingerprint ofAmomum Tsao Ko Department: Chemistry Department， College of Science Major: Chemistry Grad

2、e: 2011 Students Name: Xuanpeng He Student No.: 201101020132 Tutor: Na Wu（Lecturer） Finished by April， 2015毕业论文（设计）原创性声明本人所呈交的毕业论文（设计）是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果.对本论文（设计）的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意. 作者签名： 日期：毕业论文（设计）授权使用说明本论文（设计）作者完全了解红河学院有关保留、使用毕业论文（

3、设计）的规定，学校有权保留论文（设计）并向相关部门送交论文（设计）的电子版和纸质版.有权将论文（设计）用于非赢利目的的少量复制并允许论文（设计）进入学校图书馆被查阅.学校可以公布论文（设计）的全部或部分内容.保密的论文（设计）在解密后适用本规定. 作者签名： 指导教师签名：日期： 日期： 何宣鹏 毕业论文（设计）答辩委员会(答辩小组)成员名单姓名职称单位备注周波讲师红河学院理学院主席（组长）吴娜讲师红河学院理学院组员龙云惠讲师红河学院理学院组员徐世娟助教红河学院理学院组员 红河学院本科毕业论文（设计）摘 要论文以红河州金平县的草果为参考样品，寻找最佳静态顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS）

4、条件，优化提取和进样方式，在优化条件下，对草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）挥发性成分进行测定，同时建立草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）、不同产地（红河、楚雄、丽江、大理、玉溪、文山）、不同炮制方法（炒制、盐制、姜制、净制、醋制）的挥发性GC-MS指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对指纹图谱进行相似度计算，采用SPSS 19.0软件对指纹图谱进行聚类分析、主成分分析。GC-MS的优化条件为：分流比为20:1、柱流量为1.0、色谱柱为HP-FFAP；草果超声提取顶空进样的振荡温度为140，振荡时间为20min；草果干粉顶空进样振荡温度为150，振荡时间为1

5、0min；草果的最佳提取进样方式为：干粉顶空进样。草果不同部位共鉴定出86个化合物。对草果的不同部位、不同产地、不同炮制方法的挥发性指纹图谱进行相似度表明：草果不同部位样品差异大，分布不稳定；不同产地的草果挥发性成分和含量虽然有差异，但是分布比较稳定；不同炮制方法的草果挥发性成分很相近，而且样品分布很稳定，说明草果通过炮制后药性很稳定。对草果的不同部位、不同产地、不同炮制方法的挥发性指纹图谱进行聚类分析表明：草果果不同部位样品可以分为2类；草果不同产地样品可以分为2类；草果不同炮制方法样品可以分为3类。对草果的不同部位、不同产地、不同炮制方法的挥发性指纹图谱进行主成分分析表明：草果不同部位样品

6、共提取了3个主成分；草果不同部位共有化学成分共提取了4个主成分；草果不同产地样品共提取了3个主成分；草果不同炮制方法样品共提取了3个主成分。关键词：草果，气相色谱-质谱，指纹图谱，相似度分析，聚类分析，主成分分析 ABSTRACTTheJinping County inHonghe Prefectureof Amomum Tsao Koasreference sample,to find the beststatic headspace gaschromatography-mass spectrometry(HS-GC-MS)condition,optimization of extracti

7、onand injection method,under the optimized conditions, Thedifferent parts(fruit,fruitshell,seed,stem,leaf,bud)volatile componentswere determined,and the establishment ofdifferent parts(fruitof Amomum Tsao Ko,shell,kernel,stem,leaf,bud),different areas(Chuxiong,Lijiang,Honghe,Dali,Yuxi,Wenshan),diffe

8、rent processing methods(frying,salt,ginger,vinegar,netsystem)GC-MS fingerprint ofthevolatile,traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarityevaluationsystem 2004A version ofsoftwareto calculate the similarityoffingerprints,cluster analysis,principal componentanalysis of thefinger

9、printby SPSS 19 software.Optimization ofconditionsfor GC-MS:the split ratio was 20:1,the columnflow rate is 1,the column was HP-FFAP;ultrasonic extractiontemperature oscillationsof Amomum Tsao Koheadspaceis 140,the reaction time was 20min;the dry powderof Amomum Tsao Koheadspaceoscillationtemperatur

10、e 150 ,reaction time was 10min;the best extractof Amomum Tsao Koandsampling methodsfordry powder:Headspace sampling.Apples in different regions were identified 86 compounds.Volatilefingerprints of differentpartsofAmomum Tsao Ko,different regions,different processing methodsfor similarityshowed that:

11、large differences indifferent samples ofAmomum Tsao Ko,unstable distribution;Amomum Tsao Kovolatile constituents andcontent in different areasalthough there are differences,but thedistributionis relatively stable;not exceedingthe processing method ofvolatile componentswithvery similar,and the sample

12、distribution is verystableafterthat,through theprocessingof Amomum Tsao Koresistancestability.Volatilefingerprints of differentpartsofAmomum Tsao Ko,different regions,different processing methodsofcluster analysis showed that:the grassfruitin different parts ofthe samplecan be divided into 2 categor

13、ies;includingdifferent origin samplescan be divided into 2 categories;includingdifferentsampleprocessing methodscan be divided into 3 categories.Principal component analysisshowed thatvolatilefingerprints of differentpartsofAmomum Tsao Ko,different regions,different processing methods:Amomum Tsao Ko

14、different samples of3 principal components are extracted bydifferent parts offruit;totalchemical constituentsextracted a total of 4principal components;fruitof different origin samplesextracted a total of 3samplesincludingdifferentprincipal component;processing method of3 principal components are ex

15、tracted by.Keywords: Amomum Tsao Ko, Gas Chromatograph-Mass Spectrometry, the Fingerprint,Similarity Analysis,Cluster analysis,the Principal Component Analysis目 录1引言11.1 草果中的化学成分11.2 中药指纹图谱技术11.3 静态顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS）21.4 草果的炮制21.5 实验的分析方法31.5.1 相似度分析31.5.2 聚类分析31.5.3 主成分分析41.6 论文研究的现状41.6.1 草果的研究进

16、展41.6.2 中药指纹图谱的研究进展51.7 论文研究的内容及意义52 实验部分72.1材料、试剂及仪器72.1.1 主要材料72.1.2 主要仪器及试剂82.2 实验、仪器条件92.3 实验步骤112.3.1 样品的预处理112.3.2 样品的制备112.3.3 样品检测112.4 数据处理112.5 实验流程图123 结果与讨论133.1 草果HS-GC-MS条件选择133.1.1 草果超声提取直接进样挥发性成分分流比、柱流量、色谱柱的选择133.1.2草果超声提取顶空进样挥发性成分振荡箱温度和振荡时间的选择173.1.3草果干粉顶空进样挥发性成分振荡箱温度和振荡时间的选择203.1.4

17、 草果挥发性成分提取和进样方式的比较223.2 草果不同部位挥发性成分的测定243.3 草果不同部位挥发性成分GC-MS指纹图谱研究333.3.1草果不同部位挥发性成分指纹图谱的建立333.3.2草果不同部位挥发性成分指纹图谱的相似度分析333.3.3草果不同部位挥发性成分指纹图谱的聚类分析353.3.4 草果不同部位挥发性成分指纹图谱的主成分分析353.3.5 草果不同部位挥发性成分的主成分分析383.4 草果不同产地挥发性成分GC-MS指纹图谱研究423.4.1草果不同产地挥发性成分指纹图谱的建立423.4.2 草果不同产地挥发性成分指纹图谱的相似度分析433.4.3草果不同产地挥发性成分

18、指纹图谱的聚类分析443.3.4 草果不同产地挥发性成分指纹图谱的主成分分析453.5 草果不同炮制方法挥发性成分GC-MS指纹图谱研究483.5.1草果不同炮制方法挥发性成分指纹图谱的建立483.5.2 草果不同产地挥发性成分指纹图谱的相似度分析483.5.3草果不同炮制方法挥发性成分指纹图谱的聚类分析503.5.4 草果不同炮制方法挥发性成分指纹图谱的主成分分析504 结论54参考文献57致谢591引言草果为姜科豆蔻属多年生草本植物草果的果实，全株有辛香味，为一种药食同源的植物1，干燥成熟的草果果实既是一种传统的中药材，又是日常生活中必备的食用香辛料。具有温中、健胃、消食、顺气的功能2，主

19、治心腹疼痛、脘腹胀满、恶心呕吐、咳嗽痰多、疟疾寒热等。我国云南、广西、贵州、四川等省区都有种植3，云南是国内草果生产的主产地。草果不同部位、不同产地、不同炮制方法挥发性成分有所不同，含量也有差异，可以通过GC-MS指纹图谱对草果的差异性进行研究。1.1 草果中的化学成分草果带有香气，主要含有挥发性成分，主要是1,8-桉油素、-蒎烯、-蒎烯、对-聚伞花烃、柠檬烯、柠檬醛、樟脑、芳樟醇、壬醛、-松油醇、-水芹烯、橙花叔醇、香叶醇、草果酮、香茅醛、4-香芹薄荷酮、牛儿醛等，目前对草果的化学成分研究主要是挥发油4。此外， 研究还发现草果中含有淀粉、油脂及Zn、Mn、Cu 、Fe、Ni、Sn、Pb 等微

20、量元素。草果挥发性成分提取方法有回流提取、超临界CO2 流体萃取、超声提取、微波萃取5、顶空提取，分析方法大多为气相色谱-质谱法（GC-MS）。1.2 中药指纹图谱技术中药中药指纹图谱是指中药材或中成药经适当的处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标识该中药特性的共有峰的图谱6。通过比较供试品和标准品图谱间的相似程度, 可鉴别中药材真伪，判断中药材或中成药批次间质量差异， 从而实现中药材的质量评价和控制。中药指纹图谱主要的分析方法有有高效液相色谱(HPLC) 法、气相色谱(GC) 法、高效毛细管电泳(HPCE) 法、红外光谱( IR)法、质谱( MS)法、核磁共振( NMR) 法、X-射线衍射

21、( XRD) 法等7。中药指纹图谱有两个特点：一是通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地，二是通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的鉴定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一致。1.3 静态顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS）静态顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS）是在已达到平衡的密闭容器中液体或固体分析物的顶部空间取气态(或蒸气) 样品，并与气相色谱结合对气态(或蒸气) 样品进行分析，质谱作为检测器，准确鉴定化合物的一种比较特殊的分析技术。顶空气态取样的主要优点是避免了在直接的液体或固体取样时使复杂的样品基体成分一起被带入分析仪器系统的可能性，从而消除了由基体成分的带入

22、而对样品中可挥发性成分的分析所造成的影响和干扰8。传统分析挥发油的方法是采用水蒸气蒸馏或有机溶剂提取再进行气相色谱分析。水蒸气蒸馏和有机溶剂提取会损失掉一些低相对分子质量的萜类和小分子量的酯类等易挥发的化合物，这些化合物往往对挥发油的气味起着重要的作用。采用顶空分析法分析挥发油，可以为气味分析提供第一手信息，在含挥发油的中草药研究及其品质控制方面具有良好的应用前景。顶空分析包括静态顶空分析、动态顶空分析（吹扫捕集）、顶空-固相微萃取三大类，其中静态顶空分析法具有快速、自动化程度高、样品消耗量少、检测费用低等优点，并且可以最大程度地避免溶剂提取所带来的分析本底，近年来在挥发油的气味分析方面得到了

23、快速的发展9。1.4 草果的炮制中药必须经过炮制之后才能入药，是中医用药的特点之一。中药炮制是根据中医药理论，依照辨证施治用药的需要和药物自身性质，以及调剂、制剂的不同要求，所采取的制药技术。中药的炮制对药物疗效的影响包括对临床疗效、药性（性味、升降浮沉、归经、毒性）、药物成分的影响等10。草果的炮制在宋代以前基本上没有什么记载，宋代起，随着社会的进步和临床上的需要，草果的炮制方法兴盛起来，出现了净制、切制、煨制、火炮、制炭、麝香制、姜制等多种炮制方法，极大的丰富了草果的临床用药，近现代在历代炮制的基础上，对草果的炮制进行适当的发展，形成了现在各地不同的草果炮制方法，使草果的炮制更具操作性。不

24、同炮制方法的草果，其临床疗效、药性有所不同，主要表现在化学成分的差异上11。草果的炮制方法，自古至今有很多种，论文只列举出典型的五种，对不同炮制方法的草果的指纹图谱和化学成分进行研究。1 表1-1 草果的炮制方法炮制方法文献记载文献出处净制除去外壳，搓散，筛去膜质的假种皮12。四川省中药饮片炮制规范炒制取原药材放入锅内，用文火炒至外表黑褐，发泡，有香气时取出，放冷，筛去灰屑，用时捣碎13。云南省中药咀片炮制规范盐制取草果，除去硬壳后，将仁搓散，放入锅中，用文火加热，炒香后，喷放盐水，继续炒干，取出，晾凉。每草果100Kg，用食盐2Kg14。贵州中药饮片炮制规范姜制取净草果仁，加姜汁拌匀，置锅内

25、用文火炒干，取出，晾干。用时捣碎。每草果仁100Kg，用生姜10Kg或干姜3Kg15。中华人民共和国药典2005年版醋制醋煮16嵩崖尊生全书1.5 实验的分析方法1.5.1 相似度分析在中药指纹图谱研究中，如何运用指纹图谱所提供的信息是一个非常重要的环节。现在常用的方法是通过评价中药指纹图谱之间的相似度来判断中药的质量是否稳定合格。以相似度判断中药的质量，关键在于中药中各成分含量发生变化计算的相似度结果是否发生相应的改变。中药指纹图谱是表征中药复杂成分与其质量关系的重要手段。在表征过程中，相似度评价起着关键作用。目前常用的相似度评价方法主要有峰重叠率法（Nei系数法），相关系数法，距离系数法，

26、向量夹角余弦法与峰重叠率和共有峰强度结合法（改进的Nei系数法）。论文文采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对其指纹图谱进行相似度计算，了解各样品之间的差异和变化规律17。1.5.2 聚类分析聚类分析可以将一组数据按照本身的内在规律较合理地分为几类， 通过比较各事物之间的性质，将性质相近的归为一类，性质差别较大的归入不同类，缩小主观判断所造成的误差，具有较好的科学性和客观性18。它适用于事先并不知道对象类别的面貌，甚至连共有几个类别也不能确定的情况，符合中医认识疾病的思维方法，故目前，聚类分析在中医药研究中被逐步采用，是中医药客观化、标准化研究中的一种新的思路。论文采用SPS

27、S19.0软件对指纹图谱进行聚类分析，了解样品之间的差异和成分的变化规律。1.5.3 主成分分析主成份分析是一种常用的多元统计方法，它在社会经济、企业管理及地质、生化、医药等各个领域中都有着广泛的应用，如服装行业的服装定型、企业的经济效益分析、新开发项目目标的制订等问题19。主成份分析的目标,就是要对多变量的高维系统进行最佳简化。也就是说，要在力保数据信息丢失最少的原则下，对高维变量空间进行降维处理。论文采用SPSS19.0软件对指纹图谱进行主成分分析，了解样品的综合性、深层次特征。1.6 论文研究的现状1.6.1 草果的研究进展目前，研究者对草果的研究主要集中在基源植物、栽培技术研究、生药材

28、鉴定（性状鉴定、显微鉴定、中药化学鉴定、GC-MS 指纹图谱鉴别、气相定量测定）、中药化学成分、炮制的研究、药理作用(镇痛、抗胃溃疡、抗乙肝病毒)、临床用药（治疗乙型肝炎、治疗牛瘤胃鼓气、治疗腹部手术后腹胀）、生理功能研究等方面20。目前，对草果GC-MS指纹图谱研究，如吴惠勤等采用PR混合溶剂超声提取中药材草果的挥发油，运用GC- MS分析其化学成分及相对含量，建立草果挥发油的GC-MS 指纹图谱，化学成分相对含量较高，各组分间比例基本保持恒定，可作为草果的特征成分，为鉴别中药草果真实性及评价其质量的指标提供依据3；丁艳霞等采用GC-MS方法建立草果挥发油指纹图谱，探讨GC-MS联用技术在草

29、果挥发油质量控制方面应用的可行性，不同产地草果油的指纹图谱中各成分均得到了较好的分离，具有特征性和唯一性，作为草果油质量的控制方法21。 在HS-GC-MS优化条件下，通过质谱（MS）对草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）挥发性成分进行测定，采用峰面积归一法计算各组分的相对含量，同时建立草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）、不同产地（红河、楚雄、丽江、大理、玉溪、文山）、不同炮制方法（炒制、盐制、姜制、净制、醋制）的挥发性GC-MS指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对指纹图谱进行相似度计算，采用SPSS 19.0软件对指纹图谱进行聚类分析、主成分分析的文章未见

30、报道。1.6.2 中药指纹图谱的研究进展我国中药指纹图谱研究最早可以追踪到60年代，目前国内中药指纹图谱的研究还处在初级阶段，但近年来成为中药质量控制的研究热点之一。国内众多的研究人员正在尝试运用各种方法构建中药指纹图谱应用于中药材和中成药的质量控制，以寻求一种可行的中药指纹图谱控制质量的法定标准。由于中药注射液的特殊性，我国决定先采用中药指纹图谱控制中药中注射剂的质量。由于中药注射液的特殊性，我国决定先采用中药指纹图谱控制中药中注射剂的质量。国家药品监督管理局要求中药注射剂应固定药材产地，建立药材和制剂的指纹图谱标准”，并颁发了中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）等相应的指导原则。我国对

31、中药指纹图谱的研究目前主要为使用各处方法建立中药材及制剂的指纹图谱以及对相应信息进行数字化处理，使其能评价和控制中药材及制剂的质量。国外对于指纹图谱的研究较国内已达到了较高阶段。国外有关指纹图谱的报道无一例外地将指纹图谱作为鉴别项，评价草药的真实性以及产品质量的一致性，韩国、日本、德国等，都比较重视对植物药的开发和利用德国用指纹图谱技术控制银杏制剂的质量，在国际上具有很强的竞争力。美国FD A 已开始接受指纹图谱，在递交新药成分控制资料时，植物物质和植物产品的质量控制部分的鉴别项应包括指纹图谱。WTO在中草药指南中同样对植物制品和最终产品如果有效成分不能鉴别，可提供特征成分或混合成分的指纹图谱

32、鉴别以保证产品质理的一致性。英国、印度以及WTO 等药品管理机构，也都采用指纹图谱技术对植物药、草药质量进行评价22。目前，国外开展的植物制剂指纹图谱研究, 主要还是针对单味药材提取物而言，在植物制剂的整体性作用和药效相关性方面研究很少。1.7 论文研究的内容及意义论文以金平县草果为参考样品，对草果的GC-MS条件（分流比、柱流量、色谱柱）进行优化，对静态顶空（HS）进样条件（超声提取顶空进样和干粉顶空进样的振荡温度、振荡时间）进行优化，对不同的提取进样方式（超声提取直接进样、超声提取顶空进样、干粉顶空进样）进行优化，在优化条件下，通过质谱（MS）对草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）挥发性

33、成分进行测定，采用峰面积归一法计算各组分的相对含量，同时建立草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）、不同产地（红河、楚雄、丽江、大理、玉溪、文山）、不同炮制方法（炒制、盐制、姜制、净制、醋制）的挥发性GC-MS指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件23对指纹图谱进行相似度计算，采用SPSS 19.0软件对指纹图谱进行聚类分析、主成分分析，为草果的快速鉴别、品质的评价、质量的控制、生产工艺提供参考。 59 2 实验部分2.1材料、试剂及仪器2.1.1 主要材料草果的不同部位（壳、仁、果、茎、叶、芽）来自红河州金平县，不同产地的草果分别来自红河、楚雄、丽江、大理、玉溪、文

34、山，红河的草果来自金平县草果种植户。表2-1 草果样品的产地、不同部位的颜色产地部位颜色外观形状平均质量（g）红河壳棕黑色圆形3.5702仁黄色茎绿色叶绿色芽红色楚雄壳棕黄色、棕黑色椭圆形、圆形3.5228仁棕红色丽江壳棕黑色椭圆形3.3659仁棕黄色大理壳棕黄色椭圆形4.1099仁棕红色玉溪壳棕黑色、棕黄色椭圆形、圆形3.3509仁淡黄色文山壳棕黄色椭圆形4.6328仁棕红色2.1.2 主要仪器及试剂表2-2 主要仪器及试剂仪器与试剂型号与规格生产厂家气相色谱-质谱联用仪（配有AOC-5000自动进样器）GC-MS-QP 2010日本岛津公司超声波清洗器SK5200HP上海科导超声仪器有限公

35、司高速万能粉碎机DFY-400温岭市林大机械有限公司电子天平CP224C奥豪斯仪器（上海）有限公司电热鼓风干燥箱DHG-9070A上海-恒科学仪器有限公司电子万用炉220V，1kW浙江省上虞市通州实验仪器厂直接进样针10uL日本岛津公司静态顶空进样针10uL美国安捷伦公司中药筛100目温岭市林大机械有限公司直接进样瓶2mL北京欣惠泽奥科技有限公司静态顶空进样瓶20mL广州市鸿州实验器材科技有限公司漏斗直径：90mm深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司化学分析滤纸直径：15cm上海敬智过滤材料有限公司色谱柱： Rtx-5MS30m0.25mm0.25m美国Restek公司色谱柱： DB-170130m0

36、.250mm0.25m美国安捷伦公司色谱柱：HP-FFAP30m0.250mm0.25m美国安捷伦公司移液管10mL深圳玻璃仪器公司具塞三角烧瓶50mL深圳玻璃仪器公司烧杯50mL、100mL深圳玻璃仪器公司自封袋1217cm台州市冠龙塑业有限公司正己烷AR天津市风船化学试剂科技有限公司丙酮AR重庆川东化工有限公司生姜食醋糯米白醋加加食品集团股份有限公司食盐白象牌云南盐化股份有限公司2.2 实验、仪器条件表2-3实验、仪器条件超声条件超声时间30min料液比1:15提取溶剂正己烷超声功率200WGC条件柱箱温度80进样口温度220分流比20:1柱流量1.0ml/min总流量24.0 ml/mi

37、n吹扫流量3.0ml/min载气He（纯度99.999%，压力：13.50.5Mpa，吴江梅塞尔工业气体有限公司）气相毛细管色谱柱HP-FFAP（30m0.250mm0.25m）程序升温初始温度80，保持3min，以6/min速度升至180，保持2min总运行时间21.67minMS条件离子源温度200接口温度220检测器电压0.88KV溶剂延迟时间2minm/z35-1000直接进样条件Cycle（循环）GC-InjSyringe（针体积）10uLSample Volume（进样体积）1.0uLAir Volume（空气体积）0nLPre cln slv1（进样前清洗-溶剂1）2续表2-3直

38、接进样条件Pre cln slv2（进样前清洗-溶剂2）2Pre cln spl（进样前清洗-样品）2Fill Volume（排气体积）5.0uLFill Speed（针杆速度）5uL/sFill Stokes（拉杆次数）5Pullup Del（补偿时间）300msInject to（进样口）GC-Inj1（进样口1）Inject Speed（进样速度）50uL/sPre Inj Del（进样前补偿时间）500msPst Inj Del（进样后补偿时间）500msPst Cln Slv1（进样后清洗-溶剂1）3Pst Cln Slv2（进样后清洗-溶剂2）0静态顶空（HS）条件Cycle（循环

39、）HS-InjSyringe（进样针体积）2.5mlSample Volume（进样体积）250uLIncubat Temp（振荡箱温度）140（液体）、150（干粉）Incubat time（振荡时间）20min（液体）、10min（干粉）Agi Speed（振荡速度）250rpmAgi on Time（振荡开启时间）5sAgi off Time（振荡停止时间）2sSyringe Temp（进样针温度）80.0Fill Speed（针杆速度）200ul/sPullup Del（补偿时间）1sInject to（进样口）GC- Inj1（进样口1）Inject Speed（进样速度）500ul

40、/sSyr Flushing（气体吹针时间）120sGC-Runtime（气相运行时间）22.00min2.3 实验步骤2.3.1 样品的预处理将草果不同部位（壳、仁、果、茎、叶、芽）、不同产地（红河、楚雄、丽江、大理、文山、玉溪）、不同炮制方法（净制、炒制、盐制、姜制、醋制）的草果于万能中药粉碎机中粉碎，过100目中药筛，并储存在密封袋中，贴上标签。草果的茎、叶、芽放入电热鼓风干燥箱中，于50下烘60h，再粉碎；壳、仁、果、不同产地的草果直接粉碎，草果的炮制方法见表1-1。2.3.2 样品的制备准确称取三份1.00g的草果干粉样品，其中两份分别置于50mL的具塞三角烧瓶中，加入15.00mL

41、正己烷溶剂，超声处理30min，超声功率：200W，过滤，加5.00mL的正己烷洗涤残渣，过滤，合并滤液，取适量体积的溶液分别加入直接进样瓶和顶空进样瓶；另一份草果干粉样品直接加入顶空进样瓶，待测。2.3.3 样品检测将待测样品于GC-MS进行检测，检测条件见2.2。2.4 数据处理采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版、Microsoft Office 2013、Orgin7.5中文版、SPSS 19.0中文版进行数据处理。2.5 实验流程图图2-1 实验流程图3 结果与讨论3.1 草果HS-GC-MS条件选择3.1.1 草果超声提取直接进样挥发性成分分流比、柱流量、色谱柱的选择准确

42、称取金平县草果样品1.00g于50mL具塞三角烧瓶中，加入15.00mL正己烷溶剂，超声处理30min，超声功率：200W，过滤，加5.00mL的正己烷洗涤残渣，再过滤，合并滤液，取适量体积的溶液加入直接进样瓶。将待测样品于GC-MS进行检测，检测条件见2.2，分别改变GC条件的分流比、柱流量、色谱柱，讨论分流比、柱流量、色谱柱对草果挥发性成分提取的影响，分流比分别设置为不分流、10:1、20:1、50：1，柱流量分别设置为0.5、1.0、1.5，色谱柱分别为Rtx-5MS、HP-FFAP、DB-1701，不同分流比、柱流量、色谱柱的GC-MS图谱分别见图3-1、3-3、3-5，时间、信号三维

43、图谱分别见图3-2、3-4、3-6，图3-1 不同分流比对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的GC-MS图谱 注：从下往上分流比分别为不分流、10:1、20:1、50:1图3-2 不同分流比对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱图3-3 不同柱流量对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的GC-MS图谱 注：从下往上柱流量分别为0.5、1.0、1.5图3-4 不同柱流量对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱图3-5 不同色谱柱对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的GC-MS图谱 注：从下往上色谱柱分别为Rtx-5MS、DB-1701、HP-FFAP图3-6 不同

44、色谱柱对草果超声提取直接进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱由图3-1、3-2可以看出，当分流比为20:1时出峰较多、重叠峰少、杂峰少、峰形对称、分离效果好。分流比为10:1时峰形没有20:1时对称；分流比为10:1时出峰比20:1时少，且峰形较小；不分流时峰形虽然比分流比20：1时峰形高大，但是峰形放大之后极不对称、而且杂峰很多、重叠峰很多，分离效果最差。所以分流比为20:1时草果提取的挥发性成分多，而且准确。由图3-3、3-4可以看出，柱流量的改变对出峰的大小和多少没有明显的影响。柱流量为1.5时GC运行时间很短，出峰很快，但是有重叠峰；当柱流量为1.0时重叠峰最少，GC运行时间居中；当

45、柱流量为0.5时重叠峰也少，但是GC运行时间最长，在实验过程中耗费时间。所以柱流量为1.0时草果提取的挥发性成分多，且节省时间。由图3-5、3-6可以看出，在色谱柱Rtx-5MS、DB-170、HP-FFAP中，色谱柱HP-FFAP出峰最多，所以色谱柱为HP-FFAP时草果提取的挥发性成分最多。综上所述，当分流比为20:1、柱流量为1.0、色谱柱为HP-FFAP时草果提取的挥发性成分最多，分离效果最好，且节省时间，因此以下实验采用此GC条件为草果挥发性成分测定、GC-MS指纹图谱建立的最佳条件。3.1.2草果超声提取顶空进样挥发性成分振荡箱温度和振荡时间的选择准确称取金平县草果样品1.00g于

46、50mL具塞三角烧瓶中，加入15.00mL正己烷溶剂，超声处理30min，超声功率：200W，过滤，加5.00mL的正己烷洗涤残渣，过滤，合并滤液，取适量体积的溶液加入顶空进样瓶。将待测样品于GC-MS进行检测，GC-MS的检测条件见2.2，改变静态顶空振荡箱温度和振荡时间，讨论静态顶空振荡箱温度和振荡时间对草果挥发性成分提取的影响，静态顶空（HS）的振荡箱温度分别设置为120、130、140、150，振荡时间分别设置为10min、15min、20min、25min ，不同振荡温度、不同振荡时间的GC-MS图谱分别见图3-7、3-9，时间、信号图谱见图3-8、3-10。图3-7 不同振荡温度对

47、草果超声提取顶空进样挥发性成分影响的GC-MS图谱注：从下往上振荡温度分别为120、130、140、150图3-8 不同振荡温度对草果超声提取顶空进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱图3-9 不同振荡时间对草果超声提取顶空进样挥发性成分影响的GC-MS图谱 注：从下往上振荡时间分别为10min、15min、20min、25min图3-10 不同振荡时间对草果超声提取顶空进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱由图3-7、3-9和3-8、3-10可以看出，草果超声提取顶空进样挥发性成分的HS振荡温度为140，振荡时间为20min时，GC-MS图谱出峰较多、重叠峰少、杂峰少、峰形对称、分离效果好、

48、节省时间，因此以下干粉顶空进样实验采用此HS条件为草果挥发性成分测定、GC-MS指纹图谱建立的最佳条件。3.1.3草果干粉顶空进样挥发性成分振荡箱温度和振荡时间的选择准确称取金平县草果样品1.00g于顶空进样瓶中，于GC-MS进行检测，GC-MS的检测条件见2.2，改变静态顶空振荡箱温度和振荡时间，讨论静态顶空振荡箱温度和振荡时间对草果挥发性成分提取的影响，静态顶空（HS）的振荡箱温度分别设置为80、100、120、150，振荡时间分别设置为10min、15min、20min，不同振荡温度、不同振荡时间的GC-MS图谱分别见图3-11、3-13，时间、信号三维图谱见图3-12、3-14。图3-

49、11 不同振荡温度对草果干粉顶空进样挥发性成分影响的GC-MS图谱 注：从下往上振荡温度分别为80、100、120、150图3-12 不同振荡温度对草果干粉顶空进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱图3-13 不同振荡时间对草果干粉顶空进样挥发性成分影响的GC-MS图谱注：从下往上振荡时间分别为10min、15min、20min图3-14 不同振荡时间对草果干粉顶空进样挥发性成分影响的时间、信号三维图谱由图3-11、3-13和3-12、3-14可以看出，草果干粉顶空进样挥发性成分的HS振荡温度为150，振荡时间为10min时，GC-MS图谱出峰较多、重叠峰少、杂峰少、峰形对称、分离效果好、节省

50、时间，因此以下干粉顶空进样实验采用此HS条件为草果挥发性成分测定、GC-MS指纹图谱建立的最佳条件。3.1.4 草果挥发性成分提取和进样方式的比较在上述最佳条件下，对草果挥发性成分提取进样方式（超声提取直接进样、超声提取顶空进样、干粉顶空进样）进行比较，见图3-15。 图3-15 不同提取进样方式对草果挥发性成分影响的GC-MS图谱注：从下往上提取进样方式分别为超声提取直接进样、超声提取顶空进样、干粉顶空进样图3-16不同提取进样方式对草果挥发性成分影响的时间、信号三维图谱由图3-15可以看出，在同样的实验、仪器条件下，草果干粉顶空进样提取的挥发性成分最多，说明对于挥发性成分提取而言，顶空提取

51、比超声提取消耗少，提取效率高。综上所述，得出以下优化条件：（1）草果样品GC-MS优化条件：当分流比为20:1、柱流量为1.0、色谱柱为HP-FFAP。（2）草果样品静态顶空（HS）优化条件：草果超声提取顶空进样振荡温度为140，振荡时间为20min；草果干粉顶空进样振荡温度为150，振荡时间为10min。（3）提取和进样方式的优化：干粉顶空进样。 以下实验采取此优化条件进行。3.2 草果不同部位挥发性成分的测定分别准确称取草果不同部位（果、壳、仁、茎、叶、芽）干粉各1.00g，加入顶空进样瓶，于2.2 HS-GC-MS最佳检测条件进行检测，得到草果不同部位GC-MS离子色谱图。在GC-MS色

52、谱工作站上打开数据文件，选择积分方式：峰面积，方法：标准，选择峰面积大于0.1%的色谱峰，分别对草果不同部位的挥发性GC-MS离子色谱图进行积分，注册到质谱进行检索，输出检索结果，通过质谱图库WILEY7.LIB、NIST05.LIB进行检索，保留相似度大于90%以上的化合物，与积分后的定性峰表进行对照，并结合相关文献对检索结果进行分析，确定草果挥发性成分的化学名称、分子式，通过化合物的CAS号鉴定其结构，用峰面积归一法测定草果不同部位的挥发性成分的相对百分含量。草果不同部位挥发性成分的测定结果见表3-1。表3-1草果不同部位挥发性成分的测定结果序号保留时间（min）化合物名称分子式结构式相对

53、百分含量（%）果壳仁茎叶芽13.0352-正丁基呋喃2-butylfuranC8H12O0.190.1823.1254-甲基-1-戊醇4-methyl-1-pentanolC6H14O0.2333.2851-戊烯-3-醇1-penten-3-olC5H10O0.1843.405-水芹烯-phellandreneC10H160.200.150.470.580.170.1753.570松油烯terpileneC10H160.170.180.870.230.4263.6602-庚酮2-heptanoneC7H14O0.8873.695庚醛heptanalC7H14O0.881.910.602.433

54、.6983.825柠檬烯limoneneC10H160.250.370.250.3493.9901,8-桉叶素1,8-cineoleC10H18O5.337.684.386.4619.206.22104.235青叶醛leaf aldehydeC6H10O0.330.32114.2552-正戊基呋喃2-pentyl furanC9H14O0.160.363.481.12124.500萜品烯terpineneC10H160.140.310.210.821.840.70续表3-1序号保留时间（min）化合物名称分子式结构式相对百分含量（%）果壳仁茎叶芽134.545（E)-罗勒烯(E)-ocimen

55、eC10H160.22144.945对-伞花烃p-cymeneC10H140.550.361.041.360.34155.115萜品油烯terpinoleneC10H160.26165.1852-辛酮2-octanoneC8H16O0.300.50175.270辛醛octanalC8H16O2.611.742.131.250.764.39185.340乙偶姻acetoinC4H8O20.350.260.36195.665丙酮醇acetolC3H6O20.230.930.171.670.260.13206.175甲基庚烯酮methylheptenoneC8H14O0.970.730.822.04

56、1.6011.4216.345正己醇hexyl alcoholC6H14O0.140.150.130.170.14227.1402-壬酮2-nonanoneC9H18O0.150.91237.250壬醛nonanalC9H18O0.421.610.341.201.892.22248.055反-2-辛烯醛(E)-2-octenalC8H14O2.340.792.250.260.300.33续表3-1序号保留时间（min）化合物名称分子式结构式相对百分含量（%）果壳仁茎叶芽258.1852,4-二甲基苯乙烯2,4-dimethyl styreneC10H120.53268.330蘑菇醇mushroom alcoholC8H16O0.160.690.27278.445-荜澄茄油烯-cubebeneC15H240.210.510.450.701.06288.545醋酸glacial acetic acidC2H4O22.666.011.8714.44.37298.645水合桧烯sabinene hydrateC10H18O0.520.690.47308.870乙酸辛酯