EphA在大肠腺癌中的表达

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1、1会计学EphA在大肠腺癌中的表达在大肠腺癌中的表达第一部分第一部分大肠腺癌中EphA2表达及其与临床病理学因素、DNA倍体、细胞周期关系的研究154例大肠腺癌组织和相应正常大肠粘膜组织均来自郑州大学第一、二附属医院和河例大肠腺癌组织和相应正常大肠粘膜组织均来自郑州大学第一、二附属医院和河南省肿瘤医院南省肿瘤医院2001年年1月月2004年年12月月手术切除标本的存档蜡块手术切除标本的存档蜡块 (其中其中66例为手术切例为手术切除新鲜标本和蜡块和除新鲜标本和蜡块和88例存档蜡块例存档蜡块) 1份置份置4%多聚甲醛中固定存放多聚甲醛中固定存放另另2份置份置-82中存放中存放石蜡包埋、切片、 HE

2、染色石蜡包埋、切片，进行免疫组化提取总mRNA、进行RT-PCR实 验 标 本FCM检侧DNA倍体、细胞周期细胞增殖率技 术 路 线免疫组化（免疫组化（SP法法)FCMRT-PCR技术技术检测检测154例大肠腺癌组织例大肠腺癌组织和相应正常食管组织中和相应正常食管组织中EphA2蛋白表达蛋白表达检测检测66例大肠腺癌手术切例大肠腺癌手术切除新除新鲜鲜组织和相应正常大组织和相应正常大肠粘膜手术切除新肠粘膜手术切除新鲜鲜组织组织中中DNA倍体、细胞周期、倍体、细胞周期、细胞增殖率细胞增殖率探讨探讨EphA2表达与大肠腺癌病理临床因素、表达与大肠腺癌病理临床因素、DNA倍体、细胞周期的关系倍体、细胞

3、周期的关系检测检测66例大肠腺癌手术切例大肠腺癌手术切除新除新鲜鲜组织和相应正常大肠组织和相应正常大肠粘膜手术切除新粘膜手术切除新鲜鲜组织中组织中EphA2mRNA表达表达一一. 免疫组化免疫组化v 步骤 （略） v 对照组设计：以已知EphA2阳性食管鳞癌和正常食管粘膜腺体组织切片作为阳性对照，用正常兔IgG代替一抗作为阴性对照，用PBS代替一抗作为空白对照。v 免疫组化结果判定及定量分析：EPhA2免疫组化阳性表达位于细胞胞浆，呈棕黄色。定量分析采用高清晰图像处理系统，随机取10个高倍视野进行图像分析，对免疫组化切片检测EphA2阳性细胞数，依据阳性细胞所占肿瘤细胞面积的百分比和染色强度判

4、断结果。实 验 方 法二二 .组织中总组织中总RNA的提取及的提取及RT-PCR v步骤 （略）v RNA浓度的测定 （略）v对照设置 ：（1）阴性对照：以去离子水代替提取 的总RNA，结果阴性。v（2）内参对照：用-actin作为内参引物，与EphA2和KAI1引物分别同管扩增，结果在紫外灯下出现一条330bp的荧光带v结果判定v阳性判断标准为：目的EphA2基因RT-PCR产物凝胶电泳后在紫外灯下分别出现一条586bp的荧光带。实 验 方 法取大肠腺癌和正常大肠粘膜组织0.5g剪碎100、300目尼龙网上搓收集细胞液，800prm/min离心2min70%乙醇(4)中固定1h LPR染液,

5、避光冷藏(4)5min Stain 1ml避光30min.上机检测统计学处理EphA2mRNA及蛋白表达与大肠腺癌的关系：免疫组化结果正常粘膜 116(75.3) 6(3.9) 26（16.9） 6（3.9） 1.3690.663 腺 癌 12（7.8）32（20.8）48（22.7） 62（40.3）4.7890.542 组别 EphA2蛋白表达（例数%）a 阳性细胞面积（XS)b 0级 I级 II级 III级正常粘膜组织中正常粘膜组织中EphA2蛋白表达蛋白表达 SP法法 200大肠腺癌组织中大肠腺癌组织中EphA2蛋白表达蛋白表达 SP法法 200 EphA2蛋白表达例数(%) 组别 0

6、级 I级 II级 III级 肿瘤细胞 200(11.2) 930(45.6) 700（35.0） 170（8.2） 血管内皮细胞 170（8.3） 940（46.1） 690（34.5） 200（11.2） 注:2=1562.1481，2 =90.272， P70 30 5 (16.7) 8 (26.8) 9(30.0) 8(26.8) 0.577 性别b 男 78 7(9.0) 21 (26.8) 26(33.3) 2 4(30.9) 女 76 5 (6.6) 11(14.5) 22 (28.9) 38 (50.0) 0.074a: 2=7.580; b:2=6.928临床病理 EphA2蛋

7、白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P肿 瘤部 位c 升结肠 14 0 (0.0) 1 (7.1) 2 (14.3) 11 (78.6) 横结肠 6 1（16.7） 1(16.7) 3(50.0) 1（16.7） 降结肠 4 0(0.0) 1(25.0) 2(50.0) 1(25.0) 乙状结肠 23 3(13.0) 3(13.0) 8(34.8) 9(39.1) 直 肠 86 4(4.7) 24(28.0) 28(32.6) 29(33.7) 结肠 24 4(16.7) 2(8.3) 5(20.8) 11(45.2) 0.0798大体类型d 隆突型 108 6（5.

8、55） 25（23.14）31（28.7） 46（42.59） 溃疡型 6 0 （0.00） 3（50.0） 3（50.0） 0（0.00） 浸润型 27 3（11.11） 3（11.11）12（44.44） 9（33.33） 管周型 13 3（23.08） 1（7.70） 5（38.46） 7（53.85） 0.0228c:2=9.8600; d：2=7.5625三、三、EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系 （B)详细部位不清EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系因素的关系(C) 临床病理

9、 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P肿瘤体积(直径cm) 9.1 7 2(28.6) 2(28.6) 2(28.6) 1(14.2) 0.5332=10.723临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P分化程度a 高分化 51 3(5.0) 7(13.7) 18(35.3) 23(45.1) 中分化 41 1(2.4) 9 (22.0) 18(43.9) 13(2.4) 低分化 42 7 (16.7) 13(31.0) 10(23.8) 12(28.6) 未分化 20 1(5.0) 3（15.0） 2(10.

10、0) 14(70.0) 0.007a 浸润深度b 粘膜层（T0） 72 6(8.3) 21(29.2) 24(33.3) 21(29.1) 粘膜下层(T1) 1 0(0.0) 1(100) 0(0.0) 0(0.0) 肌层(T2) 31 2(6.5) 6 (19.4) 13(41.7) 10(32.3) 浆膜层(T3) 42 4(9.5) 2(4.8) 7 (16.7) 29(69.0) 外周组织(T4) 8 0(0.0) 2(25.0) 4(50.0) 2(25.0) 0.004bA:2=22.730 ； b:2=29.225 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级

11、 II级 III级 Pc:2=5.8205; d：2=5.565；e:2=6.8070 EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆,强度I级EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆, 强度II级EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆,强度III级EphA2在大肠腺癌组织中的表达 SP法200EphA2蛋白阳性染色定位在肿瘤区域和血管内皮细胞EphA2基因RT-PCR结果EphA2基因RT-PCR结果：- 经RT-PCR扩增，目的条带为

12、586bp。与EphA2引物同管扩增的-actin内参引物为 330bp的荧光条带。以去离子水代替提取的总RNA的阴性对照无任何荧光条带显示。 大肠腺癌大肠腺癌癌组织和癌组织和正常粘膜中正常粘膜中EphA2mRNA表达表达 1 2 3 4 5 6 M A Epha2 600bp B -actin 200bp EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系理学因素的关系(A)A：2=0.161; b: 2=1.091; c: 2=10.322k: F=6.277;l: F=0.20 ; m: F=11.405 d: 2=4.837; e: 2=10.120; n:F=0

13、.474; o: F=48465; f: 2=0.165; g: 2=2.031; p: F=2.119; q: F=0.004; h: 2=1.337; i: 2=7.081; j: 2=3.033; r: F=0.342; s: F=1.076 t:F=9.286 1 2 3 4 5 6 M A Epha2 700bp B -actin 300bp M:标准分子量(100bp DNA ladder);A: EphA2 cDNA，片段大小586bp;B：内参照-actin, 片段大小330bp; 1: 阳性对照：2：: 癌浸润浆膜层;3： 癌浸润肌层;4： 癌浸润粘膜下层;5： 对应的正常粘

14、膜6: 阴性对照EphA2在大肠腺癌组织中的在大肠腺癌组织中的RT-PCR结果结果 大肠腺癌中大肠腺癌中EphA2蛋白表达与蛋白表达与EphA2 mRNA表达的关系表达的关系 EphA2 mRNA EphA2 protein + 合计 + 17 23 40 5 21 26 合计 22 44 66 2=0.25 ，P=0.6171注: 0:I:II:III F=17.811 P0.01；0:I t=0.601 P0.05；0:II t=0.601 P0.05；0:III t=0.95 P0.05EphA2与DNA倍体、细胞周期和细胞增殖率关系c: F=1.701;d：F=0.770; m:F=2

15、.644;n: F=0.890 F=6.277;F=3.697 正常大肠粘膜组织的细胞周期分布 和DNA倍体 大肠腺癌的细胞周期分布， 出现异倍体峰 二. EphA2在大肠腺癌中的表达结果分析(2) 大肠腺癌组织中DNA倍体、DI值、及细胞殖率明显增高，表明癌细胞增值能力强，具有无限分裂增殖的特性。但与EphA2基因的表达无关，提示EphA2基因的表达与细胞的增值速度无关。1EphA2蛋白的阳性表达在大肠腺癌组织中明显高于正常大肠粘膜组织，且EphA2蛋白的高表达与癌的大体类型、分化程度及浸润深度相关，提示EphA2的高表达可能与大肠腺癌的癌变有关，并提示癌细胞具有更强的侵袭力。2EphA2蛋

16、白也定位于大肠腺癌的血管内皮细胞，提示EphA2基因表达参与了大肠腺癌的微血管生成，有望成为大肠腺癌基因治疗的新靶点。 4EphA2表达与KAI1的表达无相关性，提示在大肠腺癌中，EphA2和KAI1可能通过不同的调节通路参与大肠腺癌的发生及浸润转移。 5大肠腺癌组织中DNA异倍体、DI值及细胞增殖率明显增高，表明癌细胞增殖能力强，但与 EphA2基因的表达无关，提示EphA2基因的表达与细胞的增殖速度无关。 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P肿 瘤部 位c 升结肠 14 0 (0.0) 1 (7.1) 2 (14.3) 11 (78.6)

17、横结肠 6 1（16.7） 1(16.7) 3(50.0) 1（16.7） 降结肠 4 0(0.0) 1(25.0) 2(50.0) 1(25.0) 乙状结肠 23 3(13.0) 3(13.0) 8(34.8) 9(39.1) 直 肠 86 4(4.7) 24(28.0) 28(32.6) 29(33.7) 结肠 24 4(16.7) 2(8.3) 5(20.8) 11(45.2) 0.0798大体类型d 隆突型 108 6（5.55） 25（23.14）31（28.7） 46（42.59） 溃疡型 6 0 （0.00） 3（50.0） 3（50.0） 0（0.00） 浸润型 27 3（11

18、.11） 3（11.11）12（44.44） 9（33.33） 管周型 13 3（23.08） 1（7.70） 5（38.46） 7（53.85） 0.0228c:2=9.8600; d：2=7.5625三、三、EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系 （B)详细部位不清EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系理学因素的关系(A)A：2=0.161; b: 2=1.091; c: 2=10.322k: F=6.277;l: F=0.20 ; m: F=11.405 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因

19、素 例数 0级 I级 II级 III级 P肿 瘤部 位c 升结肠 14 0 (0.0) 1 (7.1) 2 (14.3) 11 (78.6) 横结肠 6 1（16.7） 1(16.7) 3(50.0) 1（16.7） 降结肠 4 0(0.0) 1(25.0) 2(50.0) 1(25.0) 乙状结肠 23 3(13.0) 3(13.0) 8(34.8) 9(39.1) 直 肠 86 4(4.7) 24(28.0) 28(32.6) 29(33.7) 结肠 24 4(16.7) 2(8.3) 5(20.8) 11(45.2) 0.0798大体类型d 隆突型 108 6（5.55） 25（23.1

20、4）31（28.7） 46（42.59） 溃疡型 6 0 （0.00） 3（50.0） 3（50.0） 0（0.00） 浸润型 27 3（11.11） 3（11.11）12（44.44） 9（33.33） 管周型 13 3（23.08） 1（7.70） 5（38.46） 7（53.85） 0.0228c:2=9.8600; d：2=7.5625三、三、EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系 （B)详细部位不清 EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆,强度I级大肠腺癌中大肠腺癌中EphA2蛋白表达与蛋白表达与EphA2 mRNA表达的关系表达的关系 EphA2 mRNA EphA2 protein + 合计 + 17 23 40 5 21 26 合计 22 44 66 2=0.25 ，P=0.6171EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系理学因素的关系(A)A：2=0.161; b: 2=1.091; c: 2=10.322k: F=6.277;l: F=0.20 ; m: F=11.405