STIM1在幼年和成年大鼠外伤性癫痫中的表达.docx

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1、STIM1在幼年和成年大鼠外伤性癫痫中的表达肖淳，王 文，石全红，但 炜唐兆华师艺峰李海涛二谢延风| （400016重庆，重庆医科大学附属第一医 院神经外科）摘要目的 研咒并探讨钙释放激活钙离子通道（calcium release-activated calcium, CRAC）关键蛋白STTM1在幼年和成年大鼠 外伤性癫痫中的表达差异及意义。方法取SD雄性幼年、成年大鼠各94只，按照完全随机设计分为成年、幼年假手术组：皮层注射生 理盐水，各42只；成年、幼年模型组：铁离子皮层注射外伤性癫痫模型，各52只。建模后观察大鼠癫痫行为学表现；分别于6、24、 72h, 7、14、21、28d 7_个

2、时相点完全随机选取6只大鼠，处死取伤灶周边皮层脑组织，用实时荧光定量PCR、Western blot和免疫 组织化学法分别检测STIM1的mRA与蛋白的表达，结果模型组成年、幼年大鼠均出现典型痫性发作，幼鼠模型组建模成功率为91. 3%, 成鼠模型组建模成功率为84% （定义Racine评分3分及以上为建模成功）。幼鼠模型组比成鼠模型组发作次数明显增多（R0.05）, 每次发作持续时间显著延长（R0.05）,发作程度较重。建模后各组STIM1的eRNA和蛋白表达都有明显增高，72h为高峰（R0.05）, 但幼鼠与成鼠相比较，STIM1的mKNA和蛋白在各时间点表达增高的趋势更加显著（R0.05

3、）。结论幼鼠较成缺更容易发生外伤性癫 痫，STIM1在幼鼠中较成鼠的表达也更高，提示ST1M1发达增加、CRAC激活可能是幼鼠更易发生外伤性癫痫的机制之一。关键词外伤性獭痫；CRAC通道；STIM1Expression of STIM1 in young and adult rats with posttraumatic epilepsyXiao Chun1.Wang Wen*.Shi Quanhong.Dan Wei1.Tang Zhaohua.Shi Yifeng.Li Haitao.Xie Yanfeng*(*Department of Neurosurgery, the FirstAf

4、filiated Hospital of Chongqing Medical University, chongqing 400016,China)Abstrat Objective Study and disscuss the difference and meaning in the expression of STIM1 which is the key protein in calcium release-activated calcium(CRAC) in young and adult rats with posttraumatic epilepsy.Methods SD male

5、 adult and young rats were taken each 94 only.and randomized into adult and young Sham-operated group(which were injected by saline into the cortex each 42 only)and model group(which were injected by FeC13 into the cortex each 52 only).The behavioral changes of the model group were carefully observe

6、d. After 6.24.72h and 7,14,21,28d of the injection .the rats were sacrificed and got the cortex tissue which was around the injection site. 6 rats were random selected at each time point.Real-lime fluorescence quantitalive PCR(RT-PCR) ,western blot and immunohistochemistry were used to measure the e

7、xpression of STIM1 of lhe cortex.Results Epileptic seizure was found only in the model group of adult and young rats. In the models with epilepsy induced by FeCI3 ,the achievement ratio of young group was 91.3%, but adult group only 84%(the definition of (he successful model was that the Racine scor

8、e was 3 and above). Compared with the model group of adult rats,the model group of young rats had singnificantly more epileptic seizures (P0.05),also had significantly higher severity and longer duration of epileptic seizure(P0.05).The expression of STIM 1 in the model group had significantly more t

9、han the Sham-operated group(P0.05) in each time group.and 72h group was the highest one(P0.05).Compared with the model group of adult rats,the expression of STIM I in the model group of young rats increased significantly in each time group(P0.05).Conclusion Young rats had posttraumatic epileptic sei

10、zures easier and higher severity than adult rats. The expression of ST1M1 in young rats was higher than in adult rats.suggesting that higher expression of STIM I and calcium release-activated calcium(CRAC) aclivaled minghl be one of lhe pathogenesis that young rats had easier posltraumalic epileptic

11、 seizures.(Key word posttraumatic cpilcpsy;CRAC channel;STIMl基金项目重庆市卫生局课题(2010-2-002)通信作者谢延风，电话：（023） 89011151, E-mail： xyf3058 外伤性癫痫（posttraumatic epilepsy, PTE） 是继发于颅脑损伤后的发作性功能异常，在颅脑损伤 中高达8. 9虻34%，幼年患者较成人发作率更高，其 中约半数后遗长期发作，而转化为难治性癫痫&幻。 Golden等应用FcCL注射大鼠左侧感觉皮层，成功建 立了大鼠的外伤性癫痫模型，并发现幼鼠较成鼠更易 出现癫痫发作。钙通道

12、通过神经元异常放电和胶质瘢 痕形成在外伤性癫痫发病中扮演重要角色。而新近发 现的钙离子释放激活钙离子通道（calcium release-activated calcium, CRAC）是位兴奋性细 胞和非兴奋性细胞质膜上的钙通道，Julius等国发现 它与慢性癫痫有密切的关系。STIM1是CRAC通道的关键 分子，ST1M1通过感受胞内（：疽-浓度变化从而实现CRAC 通道的开启和关闭。本实验通过大鼠皮层注射FeCk 构建成鼠和幼鼠外伤性癫痫模型，对比分析成鼠和幼 鼠痫性发作率及发作持续时间，检测STIM1的mRNA与蛋 白在幼鼠和成鼠中表达差异，探讨其与幼年外伤性癫 痫发作高的相关机制。1

13、材料与方法1.1材料100 mmol /L FeCL溶液（美国Sigma公司），兔抗大鼠 STIM1单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），肌动蛋白 （actin）鼠多克隆抗体IgG、辣根过氧化物醵标记羊抗兔二抗 （中国北京中杉金桥公司），PCR引物采用TaqMan Primer Express软件设计，由北京六合华大基因科技公司合成， Trizol RNA 抽提试剂、SYBR Green PCR Master Mix 及逆转录 试剂盒（日本TaKaRa公司）1.2动物及分组成年雄性Sprague Dawley （SD）大鼠2月龄94只，体质虽（200 20）g；幼年雄性SD大鼠3周龄94

14、只，体质量（5010）g；均由 重庆医科大学实验动物中心提供。94只成年大鼠按照完全随机 设计分为假手术组42只，模型组52只（预留10只，直至造模成 功42只）；假手术组为皮层注射pH为1.5的生理盐水5 UL,模型 组皮层注射100 nunol/L FeChSuLo 94只幼年大鼠分组与处理 同成年大鼠。1.3外伤性癫痫模型制作参照Golden等的方法，大鼠称量后以3. 5%水合氯醛溶液 （lmL/100g）腹腔注射麻醉并固定于立体定位仪上。备皮后，沿 中线剪开头皮约3cm,双氧水清理皮卜组织，剥离头顶筋膜，暴 露颅骨，在左侧颅骨冠状缝后2mm、矢状缝旁1mm处用外科显微手术钻钻孔并用微量

15、注射器将5 M L浓度为100mmcL/L、闭值为 1.5的FeCL溶液在5min内匀速注射到大鼠的感觉运动皮质区 内，进针深度3mm,注射完后，留滞针头5min。1.4外伤性癫痫模型的行为学观察及成功的判定造模后连续6h观察大鼠行为学变化，以后每天均连续观察 6h,根据改良Racine评分法：无任何癫痫发作行为记0分：凝视 发作记1分：规律性点头或湿狗样抖动，伴或不伴面部抽动记2 分：单侧前肢抖动记3分：站立、双前肢抖动及持续性点头记4 分；双侧肢体颤动加重，失去平衡跌倒而全身性强直阵挛性发 作记5分：发作衰竭导致死亡记6分。我们定义将3分及以上的行 为学改变定义为癫痫发作，并视为模型成功，

16、对造模不成功或 死亡的大鼠剔出实验，并通过随机抽样原则补齐大鼠并重新造 模气1.5标本采集成鼠模型组按照癫痫发作后6、24、72h, 7、14、21、28d7 个时相点,每组个时相点6只,用3. 5%水合筑醛溶液(ImL/lOOg) 腹腔注射麻醉，迅速断头，手术切取大鼠左大脑皮层注射区域 标本，每个标本分为三部分，一部分以4C PBS缓冲液lOOmL冲 洗3次,一部分以DEPC水(1:1000)冲洗3次，置入-80C冰箱内 保存，用于实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和western blot 的检测；一部分以4%多聚甲醛浸泡24h后予石蜡包埋，常温保存， 用于免疫组织化学的检测

17、。成鼠假手术组处理同模型组。幼鼠 分组与处理同成鼠。1.6 Real-time PCR大鼠STIM1 上游引物5 -CTGGTGGAGAAACTGCCTGAC-3,下 游引物5 -GGCTAAGAGAATGGGAAGAATCC-3r,产物长度299 bp, 将保存于-80 C冰箱中的标本组织取出，Trizol法提取细胞 总RA,微量分光光度计(美国Bio-Rad公司)检测RNA样品浓度 (A光密度值)及纯度0(260) /(280)值在1. 7-2.0范围内井 进行标化。用逆转录试剂盒将RNA逆转为cDA, 10 PL逆转录体 系中包括 2yL 10XRT Buffer, 0. 8 u L 2

18、5XdNTP mix,2yL 10X RT Random primers , 1 P L multiscribcTn Reverse Transcripase, 3. 2 u L RNAase free ddlLO, lug 总 RNA。逆转 录条件如下：25C10min,37C 120min,85C 5s,保存于-20C。 以cDNA为模板，3-actin为内参照进行实时定虽PCR反应(美国 Bio-Rad公司的iQ5 RT-PCR仪)。反应条件如下:50 C 2 min, 95 C 5min； 95 ,C 20 s, 55 笆 20 s, 72 C 30 s, 40个循 环。反应体系为25

19、叫。实时定量PCR结果采用Cl值比较相对定量 法，P-actin为内参照。数据计算步骤是：用来计算基 因的表达水平，计算公式如下：实验组相对于对照组基因表达 水平的倍数=-exp(AACt),其中(：=实验组(：-对照组 Ct, ACt=具体测定的基因Ct值-3-actin基因Ct值。表1模型组大鼠平珍1.7 Western blot法检测提取总蛋白质，并用BCA法检测蛋白质浓度并标化。以 8-actin为内参蛋白。蛋白样品加入变性缓冲液于沸水中煮 5min, 10 000 r/min离心5min后上样。十二烷基硫酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳，然后转至硝酸纤维膜。于5%脱脂牛奶中4C 封闭过夜;

20、分别加入抗STIM1抗体(1 ： 200)、抗P-actin抗体 (1 ： 3 000)置于4C籽育过夜：加入二抗(1 ： 3 750)于37eC 孵育1 ho化学发光法进行显色。蛋白定量采用Image J图像 处理软件检测。1.8免疫组织化学法检测取出石蜡块，行连续冠状切片，片厚5um,每个标本分别 制备10张切片，随机取1张然后按照说明书采用S-P法进行染 色。以PBS代替一抗作阴性对照。采用Imagc-Pr。Plus5. 0图 像分析系统对免疫组化结果进行扫描，半定量分析STIM1在假 手术组和模型组皮层中的表达。每张切片取10个不同视野，分 析每个视野阳性神经元平均光密度值(avera

21、ge opt ical density, AOD),求其算术平均值，经校正后得出每张切片的 AOD。1.9统计学处理数据以x土s表示，采用SPSS 17.0统计软件，以独立样本t 检验比较成鼠与幼鼠之间行为学及STIM1表达的差异：以方差分 析比较模型组的各时间组之间STIM1表达的差异，两两比较用q 检验。2结果2.1行为学观察假手术组未见癫痫发作。模型组在麻醉清醒后表现为头向 右偏，身体以尾根为圆心顺时针方向旋转，持续时间0.5lmin 接近2 h时，大鼠开始出现程度不的癫痫发作。如凝视、规律 性点头或湿狗样抖动，伴或不伴面部抽动，单侧前肢抖动，站 立、双前肢抖动及持续性点头，典型发作为身

22、体向右后扭转， 上半身抬起，接着整个身体背曲强直，四肢剧烈抽搐，幼鼠还 可见翻转跳起，跳起时离地高度约20cm,同时可见大鼠眼球向 外凸出，并伴随出现尿失禁现象，幼鼠发作持续时间34min, 成鼠发作持续时间l3min。发作完毕后，大鼠侧卧在地，整个 身体静止不动，出现瘫软现象，510min后大鼠恢复正常活动。 模型建立后26h期间，成鼠每2030分钟发作1次，幼鼠每1520 分钟发作1次。不论是成鼠还是幼鼠72h内发作较为频繁，以后 每天发作频率有所减少，但仍然可见典型发作。成鼠模型组痫 性发作率为84. 0%,幼鼠模型组痫性发作率为91.3%.每个时间 点的幼鼠模型组比成鼠模型组平均发作次

23、数明显增多 (RO. 05),持续时间显著增多(R0.05),且发作程度较审。见表1、2。欠数比较(次乎士s)种类 6h2-lh72h7d14d21d28d幼版 16.50+1.0522.671.7537.00 + 2.28-16. 17 + 3. 1756. 50+2. 3561.172.4。68. 502.66a： P0.05,与幼鼠比较表2模型组大鼠平均痛性发作持缤时间比较（min, xs）种类6h21h72h7dbld21d28d成鼠2. 82 0. 263. 130. 222. 600. 18*1.830.18*1.610.081.330. 101.250. 15幼鼠4. 00 +

24、0. 094. 000. 173. 70+0. 1-12. 75 0. 221.950. 101.780. 121.150. 10a： P0. 05.与幼鼠比较2.2 Real-time PCR检测成鼠与幼鼠皮层STIM1增高，差异有统计学意义（尹0.05）, 72h组表达为最高峰（P0. 05）o的mRNA表达幼鼠STIM1的表达情况相同。幼鼠模型组伤后每个时间点STIM1的表成鼠模型组伤后STIM1各个时间点的表达与假手术组比较均显著 达均较成鼠显著性增高（尹0.05）。见表3。表3外伤性痛痛成鼠及幼鼠皮层ST IM1的点NA表达水平（n=6, _x士s）种类假手术组6h24h72h7d1

25、4d21d28d成敝1.0010. 065. 85+0. 39”6. 07+0. 17*10. 59+0.806. 11+0.285. 91+0.25“5. 82也.37“5. 70也.45,幼阪1.0610.038. 62*0.62,8. 7310. 73*17.80+0. 769. 1010. 75，9.0610. 30*8. 700. 80*8. 270. 73，a: /KO. 05,与假手术组比较：b: RO. 05,模型组之间与其他时相点比较:c： R0. 05,与幼鼠相比较广STIM1-a: RO. 05,与假手术组比校：b: A0. 05.与成鼠比较；c： R0. 05,与其他

26、时相点比较2.3 Western blot检测成鼠及幼鼠皮层STIM1 蛋白表达假手术组之|hJ STIM1表达无统计学差异（丹0.05）。成鼠 模型组伤后6 h STIM1蛋白的表达水平与假手术组比较无统计 学差异（0.05）,余6个时间点的表达与假术组比较均显著 增高（R0.05）, 72 h表达最高（R0.05）。幼鼠伤后STIM1蛋 白的表达趋势与成鼠相同，且幼鼠STIM1蛋白表达增高的趋势 较成鼠更加显著（H0.05）。见图1。12345 678 16X10B-actin-42X10， A1：假手术组：2：伤后6h： 3：伤后24h： 4：伤后72h： 5：伤后7d： 6：伤后14d

27、： 7：伤后 21d： 8：伤后 28d1234 5 6 78ST1M1-ST1M1-16X10I：假手术组：2：伤后6h； 3：伤后24h： 4：伤后72h； 5：伤后7d： 6：伤后14d： 7：伤后 21d： 8：伤后 28dA：幼鼠：B:成鼠；C：定量分析结果图1 Western blot检测假手术组、幼鼠及成鼠模型组大脸皮层STIM1 蛋白的表达2.4免疫组织化学检测成鼠与幼鼠皮层STIM1的 表达在STIM1伤后表达高峰时间点（72h）.取伤灶周边皮层做免 疫组织化学法，进一步测定其蛋白的表达变化。STIM1在成鼠、 幼鼠假手术组伤灶周边皮层神经元中仅有弱阳性表达，棕色颗 粒上要分

28、布于细胞膜表面，成鼠、幼鼠假手术组之fnjSTIMl表达 无统计学差异（D0. 05）。伤后72h, STIM1在细胞膜表面的表达 虽与假手术组比较明显增加，胞质可见少虽棕色颗粒。与成鼠 模型组相比较，幼鼠模型组STIM1的表达显著性增高（R0.05）。 见图2、表4。A：成鼠假手术组：B：成鼠伤后72h模型组;C：幼鼠假手术组：D：幼 鼠伤后72h”模型组图4免疫组化观察冲成鼠及幼鼠的假手术组、成鼠及幼鼠伤后 夜h模型组ST IM1的表达情况(S2PX400)表4外伤性癫痛大鼠皮层STIM1P0性表达水平的比较(AOD值，n=6,x士s)种类假手术组伤后也h模型组成鼠0. 158+0.011

29、0. 288+0.016*幼鼠0. 172+0.0150. 351+0.011*a: P 0. 05,与假手术组比较：b: P 0. 05,与成鼠心*比较3讨论PTE易转化为难治性癫痫气临床上幼年患者较 成人发作率更高，其发病机制及防治措施是目前国内 外的研究热点和研究难点。文献报道外伤性癫痫主要 以外伤后出血、血红蛋白分解产生的铁离了沉积为启 动因素，且皮层注射铁离子能够诱发动物痫样发作及 脑电图上癫痫样放电，因此皮层注射铁离子致痫模 型己经作为动物外伤性癫痫模型被广泛研究，旦目 前已证实为一种可靠的能够模拟人类外伤后癫痫的动 物模型虬本实验在大鼠大脑皮层注射FeCL,建立FeCL外 伤性癫

30、痫模型，观察痫样发作的行为学表现。结果显 示成鼠模型组痫样发作率为84.0%,幼鼠模型组痫样发 作率为91. 3%。旦每个时间点幼鼠模型组比成鼠模型组 发作次数都明显增多，持续时间都显著延长，发作程 度也较重，这与临床相似，也与国外文献报道一致七 同时，我们也观测了钙释放激活钙离子通道 (ca 1 cium release-activated calcium, CRAC)关键蛋 白STIM1 mRNA和蛋白在外伤性癫痫中的表达变化。本 研究发现模型组大鼠皮层的STIM1 mRNA和蛋白表达较 假手术组均明显增高。众所周知过度的钙内流可致细 胞毒性，引发大剧神经元同步放电，而导致癫痫发生。 Fa

31、ria等s在大鼠椎体神经元底切的外伤性癫痫模型 中，减少N型钙通道的钙离子内流，抑制性冲动也较少 地进入椎体细胞，说明了外伤性癫痫与钙通道有密切 的关系。Julius等发现CRAC与慢性癫痫有密切的关 系，无镁溶液培养的神经元细胞用CRAC特异性阻断剂 阻断后，棘尖波的出现周期明显延长。钙离子释放激 活 钙通道 (calcium release-activated calcium, CRAC)是位于细胞质膜上的慢钙通道，对钙离子有较高 选择性，钙库中钙离子减少时可被激活o STIM1与CRAC 的通道激活密切相关。STIM1是一种主要定位于内质 网上的I型跨膜蛋白，含有多个不连续的结构域，包

32、括N端信号肽、EF-hand结构域、SAM结构域，单次跨膜 片段，C端螺旋卷曲结构域和S/P结构域等，CRAC通道 休眠的时候，STIM1二聚体上的EF-hand结合有Ca, 不能与CRAC通道相互作用，CRAC通道处于关闭状态。 铁离子致颅脑损伤后，继发Haber-Weiss铁催化反应， 促使过氧化反应，激活细胞膜磷脂酶C (PLC),作用于 PIP2使其分解为IP3和甘油二脂(DAG)o IP3与ER上的 IP3受体(IP3R)结合，引起细胞内Ca浓度轻微升高, 由此进一步引起更多IP3R通道的开放，大量的Ca?从内 质网释放到细胞质，也就是所谓的Ca?诱导了Ca的释 放，内质网Ca浓度的

33、降低，促使STIMI二聚体上的 EF-hand失去Ca*而被激活，从而激活了 CRAC通道监闾。 因此，本研究结果提示伤后大鼠皮层中STIM1表达增 高，CRAC通道因此被过度激活，可导致胞内钙超载发 生，从而最终诱发外伤性癫痫的发作。临床上幼年患者较成人发作率更高，更易转化为 难治性癫痫。因此，我们进一步研究了 CRAC关键蛋白 ST1M1在幼年和成年大鼠外伤性癫痫中的表达差异。 幼鼠较成鼠更易诱发外伤性癫痫的这一现象，国内外 研究主要集中在氧化应激的机制上，氧化应激反应导 致膜离了泵等系列病理改变，最终诱发癫痫，抗氧 化能体系是随着大鼠的年龄增长而逐渐发育完善，所 以抗敏化酶体系的相对缺失

34、导致了幼鼠更易诱发外伤 性癫痫气但抗氧化酶的多少并不能完全解释这一现 象，本研究及国内外文献的报道均说明了 ST1M1与癫 痫的发生密切相关。有研究表明，幼鼠骨骼肌中STIM1 的表达较成鼠明显增多七但STIM1在大鼠皮层的表 达是否与年龄具有一定的相关性目前尚不清楚，基于 以上研究背景，本研究发现幼鼠伤后各时间点STIM1 mRNA和蛋白的表达较成鼠均显著性增高，提示幼鼠较 成鼠更易诱发外伤性癫痫可能是与STIM1在成鼠和幼 鼠中的差异性表达，从而影响了 CRAC通道的活性相 关。另外，有众多学者认为癫痫是一种免疫疾病，CRAC 通道在T淋巴细胞、树突状细胞中是发挥免疫递呈功 能的关键信号转

35、导通路同，STIM1是一非常重要的免 疫分子，STIM1墓因变异会导致中枢神经系统发 育异常、先天性免疫功能缺陷等离了通道病，从而 推测由于STIM1表达的增高，影响了大鼠的免疫功能, 而导致免疫功能较低的幼鼠更易诱发外伤性癫痫。总之，幼鼠较成鼠更容易发生外伤性癫痫，STIM1 在幼鼠中较成鼠的表达也更高，提示ST1M1表达增加、 CRAC通道激活可能是幼鼠更易发生外伤性癫痫的机制 之一。我们有可能以此为切入点，发现幼儿外伤性癫 痫发生的新机制，找到药物防治的新靶点Lb但调控外 伤后STIM1表达变化的具体信号通路等机制的也霞深 入研究仍需要我粕作进-步壬作来探讨。参考文献：11 .Khara

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