CHAPTER分子克隆工具酶

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1、1会计学CHAPTER分子克隆工具酶分子克隆工具酶第一节 限制性内切酶1.限制与修饰现象2.限制酶的发现 命名： 宿主属名第一个字母(大写) + 种名头两个字母(小写) + 菌株号 + 罗马序号一、限制与修饰the 1st such enzyme foundEscherichia coli Species categoryR13strainHow to name a restriction endonuclease?EcoRIREBASE(The Restriction Enzyme Database)http:/New England Biolabs3.限制与修饰系统的种类II（93%）I（

2、1%）III（1%）酶分子酶分子内切酶与甲基化酶内切酶与甲基化酶分子不在一起分子不在一起三亚基双功三亚基双功能酶能酶二亚基双功二亚基双功能酶能酶识别位点识别位点4-6bp，大多数回，大多数回文对称文对称二分非对称二分非对称5-7bp非对非对称称切割位点切割位点在识别位点中或靠在识别位点中或靠近识别位点近识别位点无特异性，无特异性，在识别位点在识别位点外外1000bp在识别位点在识别位点下游下游24-26bp限制反应与限制反应与甲基化反应甲基化反应分开的反应分开的反应互斥互斥同时竞争同时竞争限制反应是限制反应是否需要否需要ATP否否是是是是5内切酶3内切酶ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口

3、缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut)3HO P53HO P5nConsider a linear DNA molecule with 6 copies of GAATTC: nit will be cut into 7 fragments which could be separated by the gel electrophoresis.(The largest fragment)(The smallest fragment)digestion of a DNA fragment with endonuclease EcoRIUse of multiple REs allows

4、 different regions of a DNA molecule to be isolated(1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2)Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.Differences of REsDifferences of REssticky ends(粘性末端) blunt ends(平末

5、端)Recognition sequences and cut sites of various endonucleasesCleavage of an EcoRI site. The 5 protruding ends are said to be “sticky” because they readily anneal through base-pairing to DNA molecules cut with the same enzyme3、非对称突出末端4、同裂酶(isoschizomer)：识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但切割位点可能不同。4、同裂酶(isoschizomer)4

6、、同裂酶(isoschizomer)4、同裂酶(isoschizomer)一、甲基化酶的种类(methylase)一、甲基化酶的种类(methylase)一、大肠杆菌聚合酶I2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途是大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶裂解后，从全酶中除去53外切酶活性的肽段后的大片段肽段，其聚合活性和35外切酶活性不受影响，相对分子质量为76103。可利用基因工程生产。Klenow DNA聚合酶作用T4 phage DNA polymerase来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，相对分子质量为114103，活性与Klenow DNA聚合酶相似，但其35外切核酸酶

7、活性强200倍，且不从单链DNA模板上替换引物，常用于诱变反应。来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，是由两种紧密结合的蛋白质形成的复合体，一种是噬菌体基因5编码的蛋白，另一个是宿主细胞的硫氧还原蛋白。活性与T4噬菌体DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶相似，但其35外切核酸酶活性为Klenow DNA聚合酶1000倍，可替代T4噬菌体DNA聚合酶功能并可用于模板的引物延伸。在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自嗜高温的细菌，主要用于PCR反应。Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶。依赖于RNA的DNA聚合酶，有53合成DN

8、A活性，无35外切酶活性。来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)和Mo-MLV (Moloney鼠白血病病毒，又称M-MuLV)。具有53聚合酶活性和很强的RNase H活性(特异性水解DNA:RNA杂交链上RNA链的磷酸二酯键，产生5核苷酸，该酶对单链的核酸、双链DNA或双链RNA没有作用)。 cDNA合成起始：引物和mRNA模板杂交体可成为RNase H的底物，模板的降解和cDNA的合成相竞争。反应终止:RNase H可在正在增长的 DNA3端切割模板，抑制cDNA的合成。AMV反转录酶RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)反转录酶是一种RNA介导的DNA聚合酶。该酶能以RNA(

9、合成cDNA时)或单链DNA做模板由引物起始合成一个互补的DNA链。RNase H活性的缺失增强了该酶合成长链cDNAs的能力。 M-MuLV反转录酶3DNA聚合酶活性(需Mg2+)，即以RNA或DNA为模板及带3-OH的RNA或DNA引物合成DNA。2.53和35外切核酸酶活性，产生含5磷酸及3-OH的长420个碱基的核苷酸。3.无35外切核酸酶校正作用，在高浓度dNTP等条件下每500个碱基会有一个错误的掺入。一、依赖于DNA的RNA聚合酶1.T4 DNA连接酶催化DNA5磷酸基与3羟基形成磷酸二酯键，反应底物为黏端、切口、平末端的RNA或者DNA。2.大肠杆菌DNA连接酶需NAD+的参与

10、，作cDNA克隆时，不会将RNA连接到DNA，不连接RNA。3.Taq DNA连接酶在两个核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接双链DNA中的缺口，作用在45-65，需NAD+,主要用于在PCR扩增中引入寡核苷酸。4.T4 RNA连接酶可以催化单链DNA或RNA的5磷酸与另一单链DNA或RNA的3羟基形成共价连接，用于标记RNA的3末端、单链DNA或RNA的连接等。T4 polynucleotide kinase 是一种磷酸化酶，可将ATP的-磷酸基团转移至DNA或者RNA的5末端:1.正反应：将ATP的-磷酸基团转移至无磷酸的DNA的5末端，用于对缺乏5磷酸的D

11、NA进行磷酸化。2.交换反应：在过量ATP存在的情况下，将DNA的5端磷酸转移给ADP,然后DNA从ATP上获得-磷酸而重新磷酸化。Calf intestinal alkaline phosphatase,简称CIP或CIAP，催化除去DNA或RNA-5磷酸的反应，通过去除5磷酸基团，可防止DNA片段自连，或标记前去除DNA或RNA的5磷酸。BAL31核酸酶(3外切核酸酶活性)S1核酸酶(降解单链DNA或RNA)绿豆核酸酶(降解单链DNA或RNA)RNase A(去除DNA样品中的RNA)DNase(降解双链或单链DNA)外切核酸酶(在dsDNA 3羟基逐一去除单核苷酸)核糖核酸酶H(水解DN

12、A:RNA上RNA上的磷酸二酯键)RNase One(Promega公司开发在所有4个碱基处切割磷酸二酯键)RNase inhibitor为RNase的非竞争性抑制剂，以非共价方式结合在RNase A类的酶上，其活性需要DTT。主要应用于cDNA合成的反应中，如RT-PCR。Agarase是一种琼脂糖水解酶，可将琼脂糖亚单位(新琼脂二糖)水解为新琼脂寡糖。用于从低熔点琼脂糖凝胶中分离纯化大片段DNA或RNA片段。对热很稳定，反应时不需要缓冲液。1.单链DNA结合蛋白 (single strand binding protein, SSB)与单链DNA结合，可以消弱链内二级结构的稳定性，从而加速

13、互补多核苷酸的重新退火，并通过消除阻碍DNA聚合酶前进的链内二级结构，提高聚合酶的持续作用能力。2.RecA蛋白来自大肠杆菌，与重组有关，可与单链DNA结合，还可促进dsDNA对同源ssDNA的吸收作用，是一个依赖于DNA的ATP酶3.拓扑异构酶主要来自小牛胸腺，通过瞬时破坏并再生磷酸二酯键，解除共价闭环dsDNA中的超螺旋。1.蛋白酶K(Proteinase K)。是具有高活性的丝氨酸蛋白酶，由霉菌产生。可以水解肽键，尤其适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键，能快速水解细胞裂解物中的DNA酶和RNA酶，有利于DNA和RNA的纯化。2.溶菌酶。是一类水解细菌细胞壁中聚糖的酶，用于破碎细胞。the 1st such enzyme foundEscherichia coli Species categoryR13strainHow to name a restriction endonuclease?EcoRI4、同裂酶(isoschizomer)：识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但切割位点可能不同。依赖于RNA的DNA聚合酶，有53合成DNA活性，无35外切酶活性。来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)和Mo-MLV (Moloney鼠白血病病毒，又称M-MuLV)。