辅助性Th17细胞在HIV

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1、辅助性 Th17 细胞在 HIV-1 长期潜伏感染中作用的相关研究目的: 获得性免疫缺陷综合征 (Acquired ImmuneDeficiency Syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒( HumanImmunodeficiency Virus,HIV-1 )感染免疫系统CD4vsup+v/supP田胞引起的一种传染性疾病,严重威胁人类健康,目前尚无有 效疫苗防治。高效抗逆转录病毒治疗( Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART能有效抑制病毒复制，控制病毒传播,可以在一定程度上恢复免 疫功能 , 提高患者的生存质量。然而，尽管HAART能

2、抑制HIV-1感染者血浆中的病毒至常规方法检测不出的水平, 但仍不能有效清除 HIV-1 感染者体内的病毒。 不管治疗时间长短 , 一旦停止 药物治疗 ,会在几日至几周之内出现病毒反弹 , 提示 HIV-1 在感染者体内是持续 存在的。如何发现并清除 HIV-1 感染者体内残余的病毒 , 是达到艾滋病治愈所面临的 重要途径。 HIV-1 细胞储存库是病毒在体内持续存在和反弹的最主要原因。HIV-1细胞储存库是指在有效 HAART台疗下藏匿和潜伏HIV-1病毒的细胞。HIV-1感染易感性较高的CD4+v/supT细胞并整合至细胞基因组 DNA内 ,大部分被感染的CD4+v/supT细胞死亡,只有

3、一小部分静息记忆 CD4+v/supT细胞留存下来成为HIV-1细胞储存库，在静息条件下不产生病 毒, 能逃逸宿主免疫杀伤 , 在体内长期存在 , 停药后 HIV-1 储存库细胞活化产生具 有复制能力的HIV并造成病毒反弹。数学模型显示 , 即使有效台疗 , 清除 HIV-1 储存库也至少需要 60 年。如果无 法找到并清除重要的HIV储存库,意味着患者终生无法脱离抗病毒治疗，持续承 受药物副作用和耐药等危害 , 也为社会造成沉重的经济负担。因此, 明确主要的病毒储存库细胞群为进一步探讨清除 HIV-1 储存库的临床 策略从而根除 HIV-1 感染, 是目前 HIV-1 感染治疗亟待解决的重点

4、问题。记忆性CD4vsup+v/supP田胞是经抗原刺激后形成的具有再次免疫应答能力的 CD4+v/supTt 田胞。从细胞发育的角度看,低分化、存活长的CD4+v/supT细胞逐步分化为 高分化、存活短的效应CD4+v/supT细胞。近期研究发现了一群拥有初始 T细胞表型和记忆T细胞功能的CD4+v/supT细胞亚群一一干细胞样记忆 T 细胞(Stem cell-like T memory cell,TSCM),具有自我更新和稳态增殖的特性,可进一步分化为中心记忆 T细胞(Central memory T cell,TCM)、过渡性记忆 T 细胞(Transitional memory T

5、cell,TTM)和效应记忆 T 细胞(Effector memory T cell,TEM) 等。新近研究发现TSCM/sub细胞是HIV-1藏匿的重要场所,可在长期治 疗后稳定留存于HIV感染者体内。因此，细胞群成为关键HIV-1储存库的重要原 因之一是具有持续自我更新和长期存活的重要特征 , 可以在体内发生稳态增殖 , 不断补充 HIV-1 储存库。从发挥功能效应的角度看,CD4+T细胞作为重要的辅助T细胞(CD4+Thelper细胞,Th细胞)，是细胞和体液免疫应答发挥作用的 关键组分。抗原入侵机体后,初始CD4+v/supT细胞在抗原刺激下发生增殖 分化,在不同细胞因子的环境下,CD

6、4+T细胞可以被极化为不同类型 的效应细胞,如Th1和Th2细胞等,分别表达转录因子T-bet和Gata-3,分泌干扰在抗感染和过敏性疾病中发挥不同生物学效应。近年来,研究者发现一种新型辅助性 CD4+v/supT!田胞群一一Th17细胞,在抗原刺激以及IL-6、IL-1和转化生长因子B （transforming growth factor,TGF- B ）等细胞因子的作用下，转录因子ROY t活化，促进IL-17、IL-21 与 IL-22 等细胞因子的分泌 , 具有募集中性粒细胞和分泌促炎性因子以保护粘膜 免疫的功能。在感染性疾病、自身免疫疾病和肿瘤相关免疫疾病中 ,Th17 细胞均 执

7、行重要功能。Th17细胞表面表达重要的趋化因子受体 6 （Chemokinereceptor 6,CCR6 , 并非均质化的细胞群，包含许多不同亚群，如CXCR3-CCR4+CCR61 （Th17细胞）、 CXCR3+CCR4-CCR6胞（Th1/17细胞），以及新近发现的 CCR6+CD9初始 T细胞 亚群（也称Th17前体细胞或干细胞样Th17细胞）。滤泡辅助性CD4+T 细胞（Follicular CD4+T helper 细胞,Tfh 细胞）是近期发现的一 种特殊的辅助性T细胞,可以辅助B细胞产生抗体参与体液免疫应答。Tfh高表达CXCR5口 Bcl-6,可分泌IL-21等细胞因子，在

8、淋巴滤泡发挥重要 的功能效应。新近发现外周循环中也存在高表达CXCR5勺Tfh细胞,与组织中的Tfh具有相似的表型和功能，而且外周循环中Tfh细胞中也含有异质性的Th1、Th2 和Th17、Th1/17等Th细胞，可发挥重要的免疫作用。研究发现，小鼠和人类的Th17细胞具有干细胞样特征，与TSCM 细胞类似 , 可以稳态增殖和自我更新 , 作为记忆性效应细胞在体内长期存活。 尽管 Th17细胞数量较少，但是由于这种干细胞样特性，使Th17细胞可以在体长期存活， 因此Th17细胞有可能成为HIV-1感染后在体内长期存在的储存库。然而,Th17细胞是否可以作为重要HIV-1储存库细胞，目前国内外尚

9、未明确 另外,外周循环中Th细胞可分为表达CXCR5勺Tfh样细胞和不表达CXCR5勺非 Tfh样细胞,Tfh样和非Tfh样Th17细胞对HIV-1储存库的贡献如何,目前国内夕卜 尚未明确。综上, 研究显示有效抗病毒治疗仍无法清除体内 HIV-1 勺重要原因之一为 HIV-1 细胞储存库勺存在 , 但 HIV-1 储存库关键细胞亚群亟待明确并值得深入研 究。尽管许多研究报道了新勺 HIV-1 储存库细胞亚群 , 然而有必要不断对于如 Th17细胞这种具有稳态增殖特性的细胞亚群进行相关研究。本研究拟对Tfh样和非Tfh样的Th17细胞对HIV-1的易感性及其可能机制 进行分析 ; 选取长期抗病毒

10、治疗的 HIV-1 感染者作为研究对象 , 使用流式分选出 不同Th细胞亚群,包括Tfh样和非Tfh样的Th17、Th1和Th2细胞,检测不同Th 细胞亚群的储存库的大小,评价Th17细胞与其他Th细胞相比对于HIV-1储存库 的贡献;分析短期治疗和长期治疗后细胞相关 HIV-1 前病毒序列特征 ,以明确 Th17细胞是否可以作为HIV-1储存库在体内长期存在,对于找到贡献HIV-1储存 库的重要细胞亚群、 制定清除 HIV-1 储存库的策略并最终清除储存库有重要意义。 研究方法 :1 、研究对象对于细胞对 HIV-1 易感性研究 , 我们选取了身体健康的正 常供者（ n=20） , 无其他免

11、疫相关疾病。研究对象签署知情同意书并经过伦理审批。对于Th17细胞HIV-1储存库研究,我们选取年龄和性别匹配的HAAR早期治疗和慢性期治疗的HIV-1感染者进 入研究,HIV-1感染者签署知情同意书并经过伦理审批，入选标准如下:HAART早 期治疗组（n=8）:入选标准：经HAART台疗后，血浆病毒载量水平被稳定控制在 50拷贝/ml （50cps/ml ）以下的患者。动态采集血液时间点为 ： 治疗后病毒水平被控制 1 年以及病毒载量被控制 5 年以上。HAAR慢性期治疗组（n=9）:入选标准：血浆病毒载量水平被稳定控制 在50拷贝/ml （ 50cps/ml ）以下的患者。采集血液时间点为

12、 ： 治疗 5 年以上。 2、实验方法（ 1）血液标本的处理采集EDTA抗凝全血50-100ml,6小时内分离血浆,-80 C冻存。密度梯度离心法提取剩余标本外周血单个核细胞（ Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs ） , 深低温冰箱冻存。（2）流式分选和流式染色复苏患 者 PBMCs使用流式抗体 CD3 CD4 CD45RA CD95 CCR4 CCR6 CXCR：和 CXCR5 等进行表面染色,流式检测发现所有CCR6的Th17细胞均表达CD95加入抗体后,在4C冰箱避光孵育20分钟，使用2%FBS-PB洗涤细胞，300g、 10分钟离心后使用2

13、%FBS-PB重悬细胞。FACSAria细胞分选仪分选目的细胞（BD Biosciences ）。细胞分选纯度大于95%对于表型检测，另加入CCR5和CXCR抗体进行表面 染色,2%多聚甲醛固定样本 ,LSRII 流式细胞仪进行上样分析 （BDBiosciences ）。流式数据分析应用 FlowJo 软件进行。（ 3）体外感染实验复苏正常供者的PBMCs分别应用携带GFFP报告基因的VSV-G假病毒、R5嗜性（Ba-L）和X4嗜性（NL4-3）的 HIV-1 病毒感染 10x106 PBMCs（感染复数 Multiplicity ofinfection,M0l=1 ）。感染 3 个小时后，用

14、 PBS洗脱病毒并在 RPMI1640/10%FBS/rhIL-2 （50 U/ml ）的培 养基 中培养 5 天。第5天,进行表面染色，使用LSRII流式细胞仪进行上样分析。（4）基因表达 检测基因表达检测包括转录因子检测和宿主限制因子检测。将分选后的Th细胞亚群进行培养,使用CD3/28磁珠将不同的Th细胞亚群活 化 3 天。移除磁珠后 , 提取细胞 RNA。使用Superscript III RT逆转录酶将RNA逆转录成cDNA使用特异性Taqman 探针检测不同Th细胞的转录因子基因表达（T-bet、Gata-3、ROY t和Bcl-6 ） 和宿主限制因子表达（SAMHD1TRIM5a

15、、CDKN1和BST2。编码-actin的Actb作为管家基因。实时定量 PCR检测基因表达，反应条件 94C,15秒;60 C ,60秒,共40个循环。2- Ct法分析不同Th细胞基因表达差异。（5）检测细胞相关 HIV-1 DNA分选出的Th细胞进行裂解，获得细胞裂解液。对于细胞总HIV-1 DNA的检测，应用目前最精准的数字液滴 PCF法。PCF条 件:95 C、10分钟;45个循环:94 C、30秒,60 C、1分钟;98 C、10分钟。使用 QX100 droplet reader 和 QuantaSoft software （Bio-Rad ）进行样品 的液滴分析。RPP3C基因用

16、于检测总HIV-1 DNA勺参考基因，（6）扩增细胞相关 HIV-1 env序列单基因法扩增不同Th细胞裂解液HIV-1 env基因V3区。根据数字液滴PCF测得的HIV-1 DNA勺浓度,计算出每个样本所需量，进行样 本稀释，以达到PCF检测小于30%勺阳性率。巢式PCF检测,外部引物envA/LA11, 内部引物 LA12/LA13。纯化PCR产物并进行测序。测得序列与参考序列HXB2进行序列比对分析，使用Bioedit V7.1.9和MEGA软件进行系统进化树分析。（7）统计分析使用Graphpad5进行数据分析和作图。盒型虚线图显示中位 数和四分位数间距。应用 Wilcoxon ran

17、k sum paired tests 、 Mann-Whitney U test 和Kruskal-Wallis test 进行差异分析 , 多重比较时进行 Bonferroni tests 校正。 使用Spearman进行相关分析。#代表使用 Wilcoxon rank sum paired tests分析后 p<0.05; 经Bonferroni tests 校正后, 统计学意义评价为:*p<0.05;*p<0.01;*p<0.005。结果:1、Th 细胞分选和鉴定对于Tfh( CD4+CD45RA-CXCR5和非 Tfh (CD4+CD45RA-CXCR5记忆性

18、Th 细胞,CXCR3+CCR4-CCF细胞富集 Th1 细胞,表达 T-bet 水平高;CXCR3-CCR4+CCR6- 细胞富集Th2细胞,表达Gata-3水平高;CXCR3-CCR4+CCF细胞富集Th17细胞, 表达ROY t水平高;CXCR3+CCR4-CCF富集 Th1/17,表达高水平的T-bet和ROR 丫 t o2、Th17细胞对HIV-1易感性及其相关机制的研究(1) Tfh样细胞对HIV-1 易感性比非Tfh样细胞高,在R5 HIV-1感染中更明显。对于R5 HIV感染,在非 Tfh样细胞中,Th2细胞对病毒的易感性最低,Th1/17细胞对病毒的易感性高；在 Tfh样细胞

19、中,Th1细胞是对R5 HIV-1易感性最低的细胞群,Th17和Th1/17细胞 是对 HIV-1 易感性最高的细胞群。对于X4 HIV感染,在非Tfh样细胞中,Th2细胞对病毒的易感性最低,Th17 和Th1/17细胞对病毒的易感性高；在Tfh样细胞中,Th1细胞是对X4 HIV-1易感 性最低的细胞群,Th17和是对HIV-1易感性最高的细胞群。对于VSV-G假病毒感 染,Th2细胞对HIV-1易感性最低。(2)对于Tfh和非Tfh样细胞,Th1/17表达CCR5水平最高,其次是Th17细胞;Th2细胞表达CCR5水平最低。Th1细胞表达CXCR水平最高,其他亚群细胞表 达水平相近。(3)

20、不同Th细胞群宿主限制因子 SAMHD1Trim5 a、BST2和 CDKN1表达 暂未发现差异。3、长期抗病毒治疗中Th17和Th1/17细胞HIV-1储存库的大小和贡献（1）在长期治疗的HIV感染者体内,Tfh和非Tfh样细胞中Th2细胞HIV-1 DNA水平最低；在非Tfh样细胞中,Th1/17细胞中HIV-1 DNA水平高于Th1和Th2 细胞；在Tfh样细胞中,Th17细胞中HIV-1 DNA水平最高。Th17和Th1/17细胞对HIV-1储存库的贡献相显著高于对 Th细胞数量的贡 献。（ 2）在纵向队列研究中 ,Tfh 和非 Tfh 样细胞中 Th1 细胞随着治疗延长 HIV-1D

21、NA水平显著下降,其他细胞亚群未发生明显改变。Th17和Th1/17细胞对HIV-1储存库的贡献随着治疗时间延长增加,Th1和 Th2细胞对HIV-1储存库的贡献随着治疗时间延长下降。4、Th17和Th1/17细胞 中前病毒序列特征分析两个患者分别经过 56 个月和 78 个月的抗病毒治疗。对两个患者Th细胞中前病毒HIV-1 env V3区的序列分析显示,Th17和 Th1/17细胞中短期治疗和长期治疗中均存在完全一致的病毒序列。对于Th1和Th2 细胞来说 , 只观察到一个患者在短期和长期时间点具有完全一致的病毒序列。而且进化树中两簇完全一致的序列显示 , 长期治疗后所有细胞亚群病毒序列

22、均与短期治疗Th17与Th1/17细胞病毒序列完全一致。结论:1、不管Tfh还是非 Tfh细胞,Th17和Th1/17细胞对R5和X4嗜性HIV-1易感性高。Th17和Th1/17细胞对R5嗜性HIV-1易感性高,其可能原因为HIV-1辅助受 体CCR5高表达。暂未发现不同Th细胞宿主限制因子（SAMHD1,Trima ,BST2和 CDKN1）a 与 HIV-1 易感性明显相关。2、HIV-1感染者经长期有效治疗后,Th17和Th1/17细胞HIV-1储存库的水 平高,对HIV-1储存库的贡献最大,而且随着治疗延长Th17和Th1/17细胞对HIV-1储存库的贡献增大。3、在短期治疗和长期治疗时,Th17和Th1/17细胞中 含有完全一致的病毒序列,提示Th17和Th1/17细胞可作为重要HIV-1储存库长期存在。