无创法与开腹法建模IUD避孕大鼠宫腔冲洗液tPA度子宫组织AKP和CA含量及造模效率的研究

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1、无创法与开腹法建模IUD避孕大鼠宫腔冲洗液t-PA度、子宫组织AKP和CA含量及造模效率的研究 中国 科技 论文 在线/0.无创法与开腹法建模 IUD避孕大鼠宫腔冲洗液 t-PA度、子宫组织 AKP和 CA含量及#造模效率的研究 1,3 2*5 师伟 ,徐丽(1. 山东中医药大学临床学院,济南 250011; 2. 山东大学附属省立医院,济南 250021; 3. 山东中医药大学附属医院,济南 250011) 摘要:目的 分析宫内节育器(IUD)避孕大鼠模型无创法(经阴道?宫颈途径)与开腹法10 建模宫腔冲洗液纤溶酶原激活物(t-PA)、子宫组织匀浆碱性磷酸酶(AKP)、碳酸酐酶(CA)变化及

2、造模效率,进一步评价成模效果。方法 选择已生育 SD 雌性大鼠 50 只,随机分为无创组、开腹组、无创假手术组、开腹假手术组、空白对照组,每组 10 只;无创组、开腹组分别采用无创法(经阴道-宫颈)和开腹法(经腹腔-子宫)置入单侧宫腔含铜 IUD,假手术组置入 IUD 后立即取出,测算两种造模法耗时长短,观察大鼠一般状态,造模第 16天检15 测宫腔冲洗液 t-PA、IUD 接触区子宫组织 AKP、CA含量及子宫内膜病理学。结果 造模效率观察,开腹组、开腹假手术组的造模耗时明显多于无创组、无创假手术组,差异均有极显著性(P0.01);大鼠造模后状态观察,造模 1-7 天内,无创组大鼠出现阴道分

3、泌物轻微增多,与空白对照组无明显差别,开腹组大鼠精神萎靡,蜷缩懒动,毛发粗糙蓬松,阴道分泌物明显增多,摄食水少,便稀,造模 10 天后恢复正常;子宫病理学观察,无创组、开腹20 组的大鼠均出现部分子宫内膜变性,以开腹组 IUD 置入端内膜炎症反应明显,间质充血水肿,小静脉扩张、瘀血明显、散在血栓,炎性细胞浸润;宫腔冲洗液 t-PA 浓度检测,开腹组、2个假手术组 t-PA均显著高于空白对照组(P0.05或 0.01),无创组与空白对照组差异无显著性(P0.05);子宫组织 AKP、CA 含量测定,无创组、开腹组、2 个假手术组的IUD 接触区子宫组织 AKP、CA含量均低于空白对照组,但差异均

4、无显著性(P0.05)。结25 论 无创法 IUD 避孕大鼠模型符合临床 IUD 避孕过程,能有效减少造模手术引发的非成模因素且建模效率高,可能更适用于临床 IUD 节育所致并发症防治的动物模型研究。 关键词:IUD 避孕大鼠;无创法与开腹法;宫腔液 t-PA;子宫组织 AKP、CA;造模效率 中图分类号:R3330 Study on uterine cavity fluid t-PA、uterine AKP、CA and modeling efficiency for IUD contraception rat model with non-invasive modeling and lap

5、arotomy modeling 1,3 2SHI Wei , XU Li 1. Clinical academy of Shandong university of traditional chinese medicine, JiNan 250011; 35 2. Affliated provice hospital of ShanDong university, JiNan 250021; 3. Affiliated hospital of Shandong university of traditional chinese medicine, JiNan 250011 Abstract:

6、 Objective To analysis uterine cavity fluid t-PA、uterine AKP、CA and modeling efficiency for IUD contraception rat model with non-invasive modeling and laparotomy modeling. Methods 50 SD female given birth mice were assigned into non-invasive、 laparotom、40 non-invasive control、laparotom control and b

7、lank control groups randomly.Copper-IUD of noninvasive group were placed into mice unilateral uterine through vagina?cervix way and that of invasive group through intraperitoneal-uterus way,which were also operated for noninvasive 基金项目:教育部博士点基金项目(203);国家自然科学基金项目编号:81001536;山东省自然科学基金项目(编号:ZR2010HQ018

8、) 作者简介:师伟,(1978-),男,讲师、主治医师,医学博士,从事中医药防治女性生殖系统炎症、节育措施并发症及副反应等疾病的研究。E-mail: sw19781214163 - 1 - 中国 科技 论文 在线/. control and laparotom control groups without IUD.Based on calculating modeling time and observing rats general state, uterine cavity fluid t-PA、 uterine AKP、 CA and endometrial pathology 45 c

9、hange would be observed after modeling 16 days.Results The modeling time of laparotom group、 laparotom control group were significantly more than non-invasive group and non-invasive control group(P0.01);In the modeling of 7days,non-invasive group rats appeared slight increase in vaginal secretions,c

10、ompared with laparotom group rats which appeared apathetic、curled lazily、shaggy、vaginal secretion increased significantly、feeding water little and stool;50 The parts of endometrial degeneration were appeared in non-invasive group and laparotom group rats.IUD entered position endometria of laparotom

11、group rats appeared the most serious inflammatory reaction that included interstitial edema、 small vein dilation、 blood stasis obviously、scattered in the thrombosis、inflammatory cell infiltration;Compared with blank control groups,a significant rise in the laparotom group、non-invasive control group

12、and laparotom control group55 (P0.05 or 0.01,which were no significant rise with non-invasive group;Compared with blank control groups,uterine tissue AKP、CA of other groups were no significant lower(P0.05). Conclusion Compared with laparotomy placing IUD, IUD contraceptive rats model with non-invasi

13、ve method were significantly decreased intraperitoneal interference factors which were not related to experimental purposes and significantly increased modeling efficiency. IUD 60 contraceptive rats with non-invasive method would better meet the pathogenesis study demand of IUD contraceptive clinica

14、l side effectsKeywords: IUD contraceptive rats; non-invasive method and laparotomy method; uterine cavity fluid t-PA; uterine tissue AKP、CA; modeling efficiency65 0 引言 宫内节育器(intrauterine device,IUD)避孕是我国育龄期女性采用的主要节育措施之1-2一,占避孕措施的 39.1%,避孕人数为全世界 IUD 避孕的 80% ,但引发的月经异常、经3期腹痛等副反应可达 20%-50% ,以放置 IUD 半年内的

15、发生率最高。目前认为,子宫局部病理改变、局部出凝血机制异常可能是 IUD 出血副反应主要病因,但其发病机制探讨受限70 于临床标本取材困难、可靠性低等不足。如何建立符合临床 IUD 避孕的动物模型将是实现其有效防治研究的解决途径。本研究以国内主要采用的经“腹腔?子宫”开腹法 IUD 建模为4-7 8-9参照 ,进一步考察前期已建立的经“阴道?宫颈”无创法 IUD 成模效果 ,考察建模差异,尝试建立更符合临床特征的 IUD 避孕大鼠模型。 1 材料与方法 75 1.1 材料 t-PA、AKP、CA 酶联免疫检测试剂盒(上海博蕴生物科技有限公司);352 型酶标仪(芬兰 Labsystems Mu

16、ltiskan MS);超低温冰箱 725(美国 THermo Forma 公司);大鼠固10定式自照明阴道窥器 (见图 1);鼻腔异物钳、眼科剪、组织剪、血管钳、缝合针、不可吸收手术缝合线(7 个“0”、3 个“0”)、洞巾布料,均购自山东博达医疗用品有限公司,80 高温高压消毒备用(120、96Kpa 持续 15 分钟);2%戊二醛浸泡消毒液、碘伏消毒液、戊巴比妥钠(生理盐水配制 0.3%浓度)、无菌手套及棉球,均购自江西草珊瑚药业有限公司;青霉素、甲硝唑注射液(河南省海天动物药业有限公司)。 - 2 - 中国 科技 论文 在线/. 1.2 实验方法 1.2.1 大鼠 IUD制备 85 开

17、腹法 IUD,选择横截面直径 0.3mm 塑料棒 35mm,在其表面螺旋缠绕 6 股工业电线紫铜丝(含铜 99.8%、横截面直径 0.1mm、长度 40mm)并螺旋固定,塑料棒前端预留 5mm未缠,后端以 7个“0”的不可吸收手术缝合线打结连接于塑料棒,预留手术线的长度 100mm。无创法 IUD,在开腹法 IUD 制作的基础上,将塑料棒前端的铜丝未缠绕区,反向打折 5mm,8,10呈钩状 。采用 2%戊二醛浸泡消毒 24h,生理盐水冲洗备用。(见图 2) 90 1.2.2 无创法 IUD放置器械的制备 采用临床一次性使用硬腰麻联合包内的操作工具,剪切 2 根不锈钢穿刺套管并首尾焊接延长至 1

18、2cm;剪切 2根不锈钢推芯并首尾粘接延长至 13cm,将其穿刺端沿纵轴向压平并纵9,11向剪开呈“Y”型 。采用 2%戊二醛浸泡消毒 24h,生理盐水冲洗备用。(见图 3) 1.2.3 IUD避孕大鼠模型的建立 8-995 无创造模法 (见图 4-9),以大鼠固定式自照明阴道窥器,无菌操作暴露宫颈,由宫颈口依次置入导丝、套管,完整撤出导丝,由套管尾口平行同步置入推芯和 IUD 至有阻碍感,至套管与推芯尾部相触,依次缓慢撤出推芯、套管,牵拉 IUD 尾端丝线有明显拮抗后,4-7于宫颈口 1cm处剪断尾丝。开腹造模法 ,无菌操作取大鼠耻骨上中线 1cm处做纵形切口101.5-2cm ,暴露一侧子

19、宫,于近卵巢侧 1.5cm处纵行打开宫腔 2mm,向阴道方向置入 IUD,100 尾丝打结固定 IUD 于宫壁并缝合宫腔,依次关腹。图1 大鼠阴道窥器 图 2 大鼠节育器(无创法、开腹法) 图 3 无创套管、推芯、导丝及组合Fig.1 rat vaginal speculum Fig.2 rat IUDnon-invasive method、 Fig.3 Casing、 push core、 guide wire、 open abdominal cavity method non-invasive IUD and its combination图 4 无创法导丝入宫颈口 图 5 套管由导丝引入

20、宫颈口 图6 IUD和推芯由套管引入宫腔 Fig.4 Non-invasive guide wire Fig.5 Non-invasive casing pipe Fig.6 Non-invasive IUD and pushing entering cervix entering cervix by guide wire core entering uterine by casing pipe - 3 - 中国 科技 论文 在线/. 图7 推注 IUD倒挂定于宫壁 图8 撤出推芯、导丝、套管等器械 图 9 牵拉 IUD尾丝确认固定于宫腔Fig.7 IUD fixed uterine wall

21、 by Fig.8 Evacuating Non-invasive Fig.9 Confirm IUD fixed uterine wall pushing core bolus method apparatus by pulling IUD anal filaments1.2.4 大鼠分组 选取 SPF级 12周龄已生育 SD 大鼠 50 只,体重(22020)g,由山东中医药大学实验动物中心提供,SCXK鲁2011 0005。实验大鼠分笼饲养于山东中医药大学实验动物中心,105 SYXK鲁20110019。按随机数字表将大鼠分为无创组、开腹组、无创假手术组、开腹假手术组、空白对照组,每组

22、10 只,无创组采用无创造模法、开腹组采用开腹造模法,分别于大鼠一侧宫腔置入 IUD,假手术组均置入 IUD 后立即取出,空白对照组自然饲养,不施加干预措施。各组造模后,均肌注青霉素 2 万单位,连续 3 天。 1.2.5 大鼠造模术后的一般状态观察 110 观察大鼠造模后的精神状态、毛发、饮食、排泄及阴道分泌物情况。 1.2.6 无创法与开腹法造模效率的计算 记录造模操作耗时,从造模手术的消毒环节开始计时,直至解除大鼠固定状态,测算不同造模法的建模效率。 1.2.7 宫腔冲洗液 t-PA测定 115 造模后第 16天,戊巴比妥钠过量麻醉处死大鼠,完整取出置 IUD 侧子宫和宫颈,沿子宫-宫颈

23、方向,以生理盐水 3ml反复冲洗宫腔,收集宫腔冲洗液,-30以下冰箱保存,酶联免疫吸附法检测 t?PA浓度。 1.2.8 子宫组织病理学观察 将已冲洗完毕宫腔液的子宫,取 IUD 接触区子宫内膜,未放置 IUD 子宫取其相应位置120 的子宫内膜,HE染色观察子宫内膜显微形态学改变。 1.2.9 子宫组织 AKP、CA测定 将已冲洗完毕宫腔液的子宫,去除宫腔 IUD,于 IUD接触区、近器区(限于 IUD 接触区外的 2mm内),横断面剪取子宫组织,未放置 IUD 的子宫,取材相应位置的子宫组织,每个子宫取 50mg,加 200ul 生理盐水,微量电动组织匀浆器匀浆后,2000 转离心 15m

24、in,125 取上清(20%匀浆液),-30以下冰箱保存,酶联免疫吸附法检测指标 AKP、CA的浓度。 1.3 统计学处理 S数据均采用 SPSS 17.0软件包进行统计学分析,以均数标准差( )表示。组间比较采用方差分析法检验,各组间两两比较用 q 检验完成。以 P0.01或 P0.05为差异进行统计检验。 - 4 - 中国 科技 论文 在线/. 130 2 结果 2.1 大鼠造模术后一般状态观察 无创组、无创假手术组,造模 1-7天内,大鼠出现阴道分泌物轻微增多,一般状态良好,与空白对照组无明显差别;开腹组、开腹假手术组,造模 3 天内,大鼠出现精神萎靡,蜷缩懒动,毛发粗糙蓬松,阴道分泌物

25、明显增多,摄食饮水减少,大便质稀,造模后第 7 天仍表135 现为精神不振,阴道分泌物较多,大便质稀,造模 10 天后的大鼠一般状态明显改善,与空白对照组无明显差别。 2.2 无创法与开腹法造模效率比较 开腹组、开腹假手术组的造模耗时多于无创组、无创假手术组,差异均有极显著性(P0.01),结果如图 10 所示。 18161412?1086420无创组 开腹组 无创假手术组 开腹假手术组 空白对照组140Xs,n10,与开腹假手术组比, P0.01;与无创假手术组比,P0.01;与开腹组比,?P?0.01。 图10 无创法与开腹法造模耗时比较 Fig.10 The modeling time

26、compare between non-invasive modeling and laparotomy modeling145 2.3 大鼠宫腔冲洗液 t-PA浓度变化 开腹组、 2个假手术组的宫腔冲洗液 t-PA浓度均显著高于空白对照组 (P0.05或 0.01),无创组宫腔冲洗液 t-PA浓度高于空白对照组,但差异无显著性(P0.05); 开腹组、开服假手术组宫腔冲洗液 t-PA浓度均显著高于无创组、无创假手术组(P0.05或 0.01),结果如表 2所示。 X150 表2 各组大鼠宫腔冲洗液 t-PA的浓度( s) Table 2 The content of t-PA in uter

27、ine cavity fluid with each group 组 别 数 量 t-PA(ng/L) ?无创组 10 2.750.66 开腹组 10 4.390.99 无创假手术组 10 3.271.01 开腹假手术组 10 4.671.04 空白对照组 10 1.590.07 注:与空白对照组比较,P0.05,P0.01;与开腹假手术组比较, P0.05, P0.01;与无创假手术组比较,P0.05,P0.01;与开腹组比较,?P?0.01。155 2.4 子宫组织病理学观察 无创组、开腹组的大鼠均出现部分子宫内膜变性,间质充血水肿,小静脉扩张、瘀血明- 5 - Modelingtimem

28、inute中国 科技 论文 在线/. 显,炎性细胞浸润,其中以开腹组的 IUD 置入端内膜炎症反应明显;无创假手术组的大鼠子宫内膜上皮完整,散见极少量白细胞,血管丰富且结构清晰;开腹假手术组表现为子宫内膜上皮基本完整,散发白细胞浸润,IUD 穿入部位的血管充血扩张、散在血栓。空白对照组160 的大鼠子宫内膜上皮完整,血管丰富、结构清晰。(见图 11-15) 图11 开腹组子宫内膜病理(100) 图12 无创组(100) 图13 开腹假手术组(100)Fig.11 endometrial pathology of Fig.12 endometrial pathology of Fig.13 en

29、dometrial pathology of laparotom group(100) non-invasive group(100) laparotom control group(100)图14 无创假手术组(100) 图15 空白对照组(100) Fig.14 endometrial pathology of Fig.15 endometrial pathology of blanknon-invasive control group(100) control group (100) 2.5 大鼠子宫组织 AKP、CA含量变化 无创组、开腹组、2个假手术组的 IUD 接触区子宫组织 AK

30、P、CA含量均低于空白对照组,但差异均无显著性(P0.05),结果如表 3 所示。X165 表3 各组大鼠子宫组织匀浆 AKP、CA的浓度( S) Table 3 The content of AKP、CA in uterine tissue homogenate fluid with each group 组 别 数 量 AKP(ng/ml) CA(ng/ml) 无创组 10 119.2531.62 13.662.98 开腹组 10 128.5833.77 12.763.56 无创假手术组 10 130.1135.43 14.033.36 开腹假手术组 10 126.0025.59 11.3

31、72.44 空白对照组 10 149.563.16 16.000.073 讨论 放置 IUD 引发的子宫异常出血、腹痛等副反应是限制该节育措施临床应用的主要瓶颈170 之一,发病机制与子宫内膜和血管形态学、前列腺素失衡和纤溶系统异常等子宫局部病变密12-16切相关 ,复制符合临床 IUD 放置过程的稳定动物模型,将能获得临床难以取材的子宫局部标本,为 IUD 出血副反应防治提供高效研究平台。 经子宫壁直接将 IUD 置入大鼠宫腔并缝扎固定的开腹法建模,是当前建立 IUD 动物模4-7型的主要方法 ,但其放置途径与临床不符。亦有学者报道经阴道-宫颈途径的开腹直视置17175 入 IUD,不损伤内

32、生殖器官而更符合临床避孕过程 。目前的动物用 IUD 主要包括将临床18-19IUD 直接应用或修剪后使用于实验动物 。本研究采用的经阴道-宫颈途径无创法建立8-9IUD 大鼠模型,在前期已考评了模型的成模率、避孕率和宫腹腔冲洗液相关生化指标等 ,在此基础上,进一步比较不同造模效率、对照其与临床相关指标相似性,将能完善无创法建- 6 - 中国 科技 论文 在线/. 立 IUD 避孕大鼠模型的评价。 180 临床放置 IUD 为局部宫腔操作,经人体腔道“阴道-宫颈”置入,无明显机体损伤,较少引发患者的创伤性应激反应且操作简单、快捷,但目前的 IUD 动物模型采用开腹法的经腹腔-宫壁置入 IUD,

33、存在创伤较大、易引起非造模刺激因素而导致动物模型的不稳定性,且操作较繁琐、感染机率高。本研究证实无创造模法大鼠仅在造模 1-7天内阴道分泌物轻微增多,开腹造模法大鼠造模 3天内明显精神萎靡,毛发粗糙,阴道分泌物明显增多,摄食水185 少、便稀,造模后第 7天仍精神不振,阴道分泌物较多,大便质稀。在造模耗时方面,开腹法耗时明显多于无创法,提示后者操作简单、易于掌握,保证了建模成功率的稳定性。 t-PA(tissue type plasminogen activator)是一种单链糖蛋白,分子量 6.8 万7.2万,含527 个氨基酸,通过裂解纤溶酶原肽键而发挥纤溶作用,并直接或间接参与炎症反应。

34、在各种炎症反应初期(各种外伤、感染、过敏等),血管内皮损伤和白细胞浸润可释放 PA降解190 基质中蛋白质,并通过其激活纤溶系统,使基质支架蛋白质水解,导致细胞膜破坏而加重炎20-21 22症反应 ,且纤维蛋白降解产物 FA、FB 等炎症介质进一步加剧组织和血管损害 。本研究在大鼠宫腔放置 IUD后,因局部组织创伤和铜离子释放, 引起子宫内膜损伤而释放 t-PA,模型组、假手术组大鼠宫腔冲洗液 t-PA浓度均高于空白对照组,这与临床放置 IUD 出血副反应患者检测的月经血中 t-PA含量增高相一致, 但宫腔冲洗液 t-PA以无创组上升幅度最小,195 而开腹组和开腹假手术组上升最明显,表明无创

35、造模法的创伤性明显小于开腹法。子宫内膜局部组织病理学观察也证实,无创法造模的炎细胞浸润、血管充血扩张、血栓形成等非造模目的性创伤,显著低于开腹造模法,提示无创法 IUD 避孕大鼠模型能有效减少造模手术引发的非成模因素,成模效果更符合临床 IUD 避孕过程。 子宫内膜组织均能检测出 AKP(alkaline phosphatase)、CA(carbonic anhydrase),AKP200 是非特异性磷酸脂水解酶类,与组织的再生和分化密切相关,参与细胞膜吸收和转运过程,23参与粘多糖的形成,在糖原分解时增加细胞膜通透性 。研究表明,子宫内膜增生晚期, IUD放置的月经正常女性及月经过多患者 A

36、KP活性均明显低于未放器对照组,可能与 IUD 铜离子破坏 AKP酶分子二硫键构型或与其拮抗锌离子二抑制 AKP有关,也可能是铜离子直接阻24断甾体激素功能而降低 AKP 活性有关 。CA 是一族含锌酶,存在于哺乳动物所有组织器205 官中,至少有 14 种同工酶,分别参与机体的气体运输、酸碱调节和组织分泌等功能,在子宫组织中主要发挥分泌和维持局部微环境稳定作用,放置含铜 IUD 后,铜离子与 CA 活性功能区的锌离子发生竞争而抑制性的减弱 CA活性,从而可能直接降低子宫内膜的分泌功能25-26。本研究证实, IUD 避孕大鼠的子宫组织 AKP、 CA含量均出现下降趋势,符合临床 IUD避孕女性的子宫内膜 AKP、CA变化趋势,开腹法大鼠子宫组织 AKP、CA降低幅度最大,210 但各组间差异均无显著性,提示 IUD 避孕大鼠开腹法改进后的无创造模法,符合临床 IUD避孕的子宫内膜酶学变化趋势,模型的稳定性较好,能较好反映临床 IUD 出血等副反应发病机制研究的动物建模需求。 无创法建立的 IUD 避孕大鼠模型,将在 IUD 出血副反应等发病机制的实验研究中,进一步考察模型的临床代表性、稳定性和可推广性,并对相关宫腔病变类妇科疾病动物模型提215 供新的建模方法。参考文献 References 1 乐杰.妇产科学第六版M.北京:人民卫生出版社,2005,387. - 7 -