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1、附件1食品安全地方标准“调制乳中牛奶碱性蛋白的测定”（征求意见稿）征求意见表序号地方标准章条编号意见内容修改意见填表人： 单位名称：联系电话： 联系地址： （表格不够，请复印，请于6月30日前返回）附件2食品安全地方标准调制乳中牛奶碱性蛋白的测定编制说明（征求意见稿）一、制定标准的必要性和可行性中华人民共和国卫生部2009年第18号公告中，批准牛奶碱性蛋白为新资源食品。另外，由于牛奶中成分复杂，含有多种蛋白质，而牛奶碱性蛋白是从牛奶中分离得到的蛋白质，当在牛奶中加入牛奶碱性蛋白时，就需要有检测方法来监测牛奶中牛奶碱性蛋白的含量，进而避免虚假宣传。其次，牛奶碱性蛋白对热极为敏感，同样需要有检测方
2、法对终产品中的牛奶碱性蛋白进行监测，避免企业将加工过程中损失的牛奶碱性蛋白计入产品中。随着新资源食品的批准，该产品必将应用于各类食品中，虽然在乳制品的应用只有蒙牛公司，该产品的热卖必将引领国内其它乳制品公司的效仿，因此制定该方法为食品安全地方标准是非常有必要和可行的。二、工作简况由于牛奶碱性蛋白的检测方法目前无国家标准，为了规范牛奶中添加牛奶碱性蛋白产品的检测，由内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司于2006年6月开始，着手进行调制乳中牛奶碱性蛋白的测定检验方法的开发，历经查阅相关文献、申购试验材料、试验摸索、正式试验研究、第三方实验验证五个步骤，至2009年11月完成方法的确定。三、制定标准的
3、原则和主要技术依据依据碱性蛋白的提取方法开发了该方法，该分离方法分别来自于FDA关于牛奶碱性蛋白（bovine milk basic proteinfractionBMBPF)制备方法。FDA的网址为：http:/www.cfsan.fda.gov/rdb/opa-g196.html。牛奶碱性蛋白是等电点大于7的一类蛋白，该类物质可被阳离子交换层析柱吸附，通过调整洗脱液的离子浓度将其从阳离子交换柱上洗脱，用凯氏定氮法测定牛奶碱性蛋白的含量。四、采用国际标准或国外先进标准情况针对牛奶中牛奶碱性蛋白含量的测定，目前还没有现行的国家及国际标准。目前使用中的方法主要以毛细管电泳法对其中的乳铁蛋白和过氧
4、化物酶进行检测，该方法虽然定量准确，但却依赖于大型精密仪器，不适用于各类化验室的普及应用，同时也不能对所有的牛奶碱性蛋白碱性进行全部定量，只能检测其中的部分成分。本标准制定的应用离子柱纯化提取目标蛋白后经凯氏定氮法进行定量的常规检测方法，具有操作方便、不需要昂贵仪器设备、便于普及推广等优点，为牛奶碱性蛋白的检测提供了仪器分析以外的另一选择，可以大大节省检测成本，尤其适用于基层实验室或乳品企业的质量监控。凯氏定氮法是食品蛋白质检测的经典方法，本标准拟以应用离子柱纯化提取目标蛋白后经凯氏定氮法进行定量的方法进行牛奶碱性蛋白含量的检测。五、本标准与现行法律、法规、国家相关标准和产业政策的情况说明无不
5、一致。六、重大分歧意见无。七、贯彻地方标准的要求和措施建议通过标准发布，明确标准实施日期，对适用该类方法的产品按照实施日期统一实施。八、其他应当予以说明的事项无。 附件3DB内蒙古自治区地方标准DB 15/ XXXXXXX食品安全地方标准调制乳中牛奶碱性蛋白的测定regional food safety standard Determination of milk basic protein in modified milk（征求意见稿）XXXXXXXX发布 XXXXXXXX实施内蒙古自治区卫生厅 发 布DB15/ XXXXXX前言本标准由内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司提出。本标准由内蒙古
6、自治区卫生厅批准并负责解释。本标准主要起草单位： 本标准主要起草人： DB15/ XXXXXX调制乳中牛奶碱性蛋白的测定1 范围本标准规定了调制乳中牛奶碱性蛋白含量的测定。本标准适用于添加牛奶碱性蛋白的调制乳中牛奶碱性蛋白含量的测定。本标准规定的方法检出限为0.5mg/100g。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5009.5 食品中蛋白质的测定GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理牛奶碱性蛋白为等电点大于7（pH）的一类蛋白，该类
7、物质可被阳离子交换层析柱吸附，通过调整洗脱液的离子浓度将其从阳离子交换柱上洗脱，用凯氏定氮法测定牛奶碱性蛋白的含量。4 试剂和材料使用分析纯试剂，实验用水应符合GB/T 6682中三级水的要求。4.1 磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）71.632g，加水溶解后并稀释至1000 mL。4.2 磷酸二氢钠溶液（0.2 mol/L）：称取磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）31.2g，加水溶解后并稀释至1000 mL。4.3 磷酸盐缓冲溶液（pH 6.5，0.01 mol/L）：将磷酸氢二钠溶液（4.1）和磷酸二氢钠溶液（4.2）按31.5：68.5的
8、比例混合配制成pH为6.5的0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，再以水稀释20倍制得0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液，以磷酸氢二钠溶液（4.1）和磷酸二氢钠溶液（4.2）调节校正pH值至6.50.05。4.4 氯化钠溶液（2mol/L）：称取58.44g氯化钠，加水溶解后并稀释至500 mL。4.5 氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：称取10g氢氧化钠，加水溶解后并稀释至500 mL。4.6 盐酸溶液（1mol/L）：吸取9mL浓盐酸，加水溶解后并稀释至100 mL。4.7 洗脱液（1mol/L NaCl磷酸盐缓冲溶液）：称取58.44g氯化钠于100ml烧杯中，加磷酸盐缓冲溶液（4.3）溶解后
9、并稀释至1000 mL。4.8 硫酸铜（CuSO45H2O）。4.9 硫酸钾（K2SO4）。4.10 硫酸（H2SO4 密度为1.84g/L）。4.11 硫酸标准滴定溶液（0.0200 mol/L）：c (1/2H2SO4)0.02 mol/L。DB15/ XXXXXX4.12 硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000 mL。4.13 氢氧化钠溶液（400g/L）：称取400g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至1000mL。4.14 甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。4.15 溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：
10、称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。4.16 亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。4.17 混合指示液：2份甲基红乙醇溶液（4.14）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（4.16）临用时混合。也可用1份甲基红乙醇溶液（4.14）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（4.15）临用时混合。4.18 乙醇溶液：体积分数为70%。4.19 阳离子层析树脂（CM sephandex C50或同等性能阳离子层析树脂）。5 仪器和设备5.1 分析天平：感量为0.001g。5.2 酸度计。5.3 层析实验系统：包含有电导采集器以及核酸蛋
11、白检测仪。5.4 微定氮蒸馏装置或自动凯氏定氮仪。5.5 高速离心机：5000g（或转速10000转/min）。5.6 层析柱：16400mm。6 分析步骤6.1 样品处理6.1.1 称取牛奶50100g（精确至0.001g）于烧杯中，用4.6溶液调节pH为4.60.05，静置30min。6.1.2 将静置后的样液转移至离心管中，离心（5000 g 或转速10000转/min；20min），乳清液移入洁净干燥的烧杯中。6.1.3 乳清液用4.5溶液调节pH为6.50.05，移入离心管中离心（5000 g或转速10000转/min；20min）,上清液备用。6.2 层析柱平衡取阳离子交换树脂0.
12、50g，用4.3溶液浸泡48h，使树脂充分溶胀。装柱，用减压法除去树脂中存留的气泡，使得层析柱材料分布均匀，然后用四倍柱体积4.3溶液平衡，使核酸蛋白检测的基线趋于稳定。6.3 层析分离6.3.1 从上清液中取1520mL,加样于阳离子交换柱上，用4.3溶液洗脱至基线趋于稳定，再用4.7溶液洗脱，收集洗脱蛋白峰，阳离子交换柱上用4.3溶液平衡，使核酸蛋白检测的基线趋于稳定。6.3.2 重复6.3.1步骤，直至所有上清液全部过柱并收集蛋白峰。6.3.3 将所有蛋白峰收集物合并待用。DB15/ XXXXXX注1： 牛奶碱性蛋白阳离子层析图谱6.4 蛋白含量的测定将6.3.3所得收集物依据GB 50
13、09.5第一法进行蛋白测定。消化时加入4.9试剂6g，4.8试剂0.2g，将所有收集溶液全部加入消化管后，加入4.10试剂20mL；样品消化好后定容至100ml容量瓶内，取20ml消化液，加入4.13溶液10mL蒸馏，以4.12溶液10mL吸收；用4.11溶液进行滴定。7 分析结果的表述试样中牛奶碱性蛋白的含量按式（1）进行计算。（V-V0）c0.0140F1000X = -100 （1）mV1/100式中: X试样中牛奶碱性蛋白的含量，mg/100g；V试液消耗硫酸标准滴定溶液的体积，mL；V0空白消耗硫酸标准滴定溶液的体积，mL；V1吸取消化液的体积，mL；m试样的质量，g； c硫酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；0.01401.0 mL 硫酸c (1/2H2SO4)1.000 mol/L标准滴定溶液相当的氮的质量，g；F氮换算为蛋白质的系数，6.38。8 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10。9 层析柱再生与洗脱上述实验步骤完成后，需用5倍柱体积的4.5溶液或4.18溶液清洗，再用5倍柱体积的4.4溶液再生，最后使用4.3溶液平衡，使核酸蛋白检测的基线趋于稳定，以备下次实验使用。 9
食品安全地方标准╲〞调制乳中牛奶碱性蛋白的
