基因工程制药的发展及应用

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1、基因工程制药的研究和应用摘要：随着20 世纪 70 年代 DNA重组技术的建立，基因工程制药开始得到迅速的发展，随着基因组和蛋白质组研究的深入,基因工程药物将有更多的机会获得突破性进展。本综述主要从基因工程制药的发展、种类、应用和进展作一概述。关键词：基因工程 制药 应用1. 引言生物学发展推动着医学迅猛发展,特别是生物技术在临床医学上的应用,丰富了对疾病诊断、预防和治疗的新方法。二十世纪七十年代基因工程技术的诞生为医学发展注入了新鲜血液。基因工程制药是指按照人们的意图,将外源基因整合入宿主基因组中,表达具有生物学活性的蛋白药物。基因工程制药的快速发展开发了一系列针对疑难病症的工程药物,极大程

2、度地改善了人们的生活品质。当传统制药业的增长速度减慢时，基因工程制药正在加速发展， 全世界基因工程药物持续 6 年销售额增长率都在15%33%，基因工程制药已成为制药业的一个新亮点1-2。基因工程药物自年问世以来,每年平均有一个新药疫苗问世, 开发成功的约五十个药品已广泛应用于治疗癌症、肝炎、发育不良、糖尿病、囊纤维变性和一些遗传病上, 在很多领域特别是疑难病症上,起到了传统化学药物难以达到的作用。其原因在于,基因工程制药物的研究与开发多是以对疾病的分子水平上的有了解为基础的,往往会产生意想不到的高疗效。基因工程制造药行业在近二十年中的飞速发展是以分子遗传、分子生物、分子病理、生物物理等基础学

3、科的突破, 以及基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程和蛋白质工程等基础工程学科的高速进展为后盾的。基因工程药物的开发时间为一年,比开发新化学单体一年要短一些，适应症不断延伸也是蛋白类药物的一大特点1。基因工程药物又称生物技术药物,是根据人们的愿望设计的基因,在体外剪切组合,并和载体DNA 连接,然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞) ,使目的基因在靶细胞中得到表达,最后将表达的目的蛋白质纯化及做成制剂,从而成为蛋白类药或疫苗2。目前人类60 %以上的生命科学成果集中应用于医药工业。这些药物包括细胞因子、菌苗、疫苗、毒素、抗原、血清、DNA 重组产品。体外诊断试剂等等,在预

4、防、诊断、控制乃至消灭传染病,保护人类健康,延长生命过程中发挥着越来越重要的作用。基因工程药物引入医药产业,由此引起了医药工业的重大变革,使得医药产业成为最活跃、发展最快的产业之一。2. 发展历史和现状20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。基因药物经历了三个阶段：第一阶段是把药用蛋白基因导入到大肠杆菌等细菌中，通过大肠杆菌等表达药用蛋白，但这类药物往往有缺陷，人类的基因在低等生物的细菌中往往不表达或表达的蛋白没有生物活性。第二阶段是人们用哺乳动物的细胞代替细菌，生产

5、第二代基因工程药物。但由于哺乳动物细胞培养条件相对苛刻，生产的药物成本居高不下。第一、二代基因药物的研制和生产已经成熟。从第一个反义核酸药物Vitrovene于1998年和1999相继在美国和欧洲上市以来，发展迅速。第三阶段是到了80 年代中期，随着基因重组和基因转移技术的不断发展和完善，科学家可以将人们所需要的药用蛋白基因导入到哺乳动物体内，使目的基因在哺乳动物身上表达，从而获得药用蛋白。携带外源基因并能稳定遗传的这种动物，我们称之为转基因动物。由于从哺乳动物乳汁中获取的基因药物产量高、易提纯。90年代中后期，国际上用转基因牛、羊和猪等家畜生产贵重药用蛋白的成功实例已有几十种，一些由转基因动

6、物乳汁中分离的药物正用于临床试验，但还没有一例药品成功上市。基因工程药物的研究主要针对功能基因组和基因转录本mRNA，两类生物大分子，以基因为靶的药物研发有3种手段：同源重组基因剔除，与DNA或RNA作用的合成寡核苷酸，以及和DNA或RNA结合的其它分子3。据不完全统计，欧美诸国目前已经上市的基因工程药物近100 种，还有约300 种药物正在临床试验阶段，处于研究和开发中的品种约2 000 个。近两年基因药物上市的周期明显缩短，与一般药物研究开发相比，基因工程药物研究投入大。基因重组技术的发源地和众多基因工程药物的第一制造者美国，每年在这方面的投资高达数十亿元，制定了相应的优惠政策以刺激其发展

7、，已成为国际公认的现代生物技术研究和开发的“领头军”。日本、欧洲等地也都根据各自的特点制定出符合本国国情的发展战略和对策，亚洲的韩国、新加坡等也着手这方面的研究和开发4。我国这项技术虽然起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视，为跟踪世界新技术革命迅猛发展的浪潮，863计划得到党中央、国务院的批准，并将现代生物技术列为“863 计划”最优先发展的项目和国家“七五”、“八五”、“九五”攻关项目。我国的这一重大决策为现代生物技术在我国的发展提供了良好的机会。经过广大科技工作者的艰苦努力，已取得了很大的进展。一批基因工程产品的上游研究正在努力展开，一些产品正逐步进入研究开发阶段，不少产品

8、已步入临床试验阶段或已获得新药证书，进入工业化生产5。3基因工程：基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将目的基因和载体在体外进行剪切、组合和拼接，然后通过载体转入受体细胞（微生物、植物或植物细胞、动物或动物细胞），使目的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。自 20 世纪 70 年代基因工程诞生以来，最先应用且目前最为活跃的是在医药领域，尤其在新药的研究、开发和生产中得到日益广泛的应用。4基因工程制药基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去

9、，在受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病的药用蛋白质。利用基因工程技术生产药物的优点是：（1）大量生产过去难以获得的生理活性物质和多肽，为临床应用提供有力保障；（2）发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（3）对内源生理活性物质的不足之处进行改造和去除；（4）可获得新型化合物，扩大药物筛选来源3。4.1 基因工程药物治疗肿瘤李振宇6等制备慢病毒载体为基础的野生型及突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因工程T 细胞并研究应用HSV2sr392TK/ ACV 系统进行防治GVHD ,以达到减轻前体药物毒性,拓宽前体药物选择范围的目的。高丽等7研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI) 诱

10、导HL260 细胞凋亡的作用,结果表明来自蓼科植物的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂能够有效的抑制HL260 肿瘤细胞的生长,抑制作用呈剂量依赖性,但对正常外周血单核细胞的生长没有影响。进一步研究这类药物有望使其成为一种理想的抗肿瘤靶向治疗药物。韩明勇等8采Lipofectamine2000 将携人IL218基因的质粒pCDNA3112hIL218 转导入Bcap37 细胞中,并筛选出阳性克隆。裸鼠致瘤实验和抗瘤实验表明IL218 基因转染降低了Bcap37细胞的肿瘤原性,IL218基因修饰的Bcap37 细胞具有明显的抗肿瘤作用。该药于2003经国家食品药品监督管理局(SFDA)批准上市的重组改构人肿

11、瘤坏死因子(rmhTNF) 属于国家一类新药,是高活性、低毒性的基因工程TNF。金阳等9对比研究了rmhTNF联合化疗治疗人小细胞肺癌(SCLC)的临床疗效和安全性。结果联合化疗的疗效显著优于单纯化疗,能明显改善SCLC 患者的生活质量,且临床应用安全。4.2 基因工程药物治疗病毒感染杨延梅等10应用安福隆(第二代基因工程干扰素)治疗慢性乙型病毒性肝炎患者45例,第1个月每天肌肉注射1次安福隆500万单位，后改为隔天肌肉注射1次,疗程为6个月，与给予甘利欣、维生素C等保肝药物治疗的对照组47例进行了比较。结果治疗组肝功能复常率、HBV2DNA阴转率、HBeAg 阴转率、HBeAb 阳转率均明显

12、高于对照组并有显著统计学意义。该临床研究证明安福隆治疗慢性乙型病毒性肝炎疗效确切。胡立华等11观察了重组基因工程药物干扰素与胸腺肽联合治疗慢性乙型肝炎的疗效,治疗组32 例采用IF12Na2Ib干扰素500 万单位肌肉注射,开始时1次/d ,持续2周,此后3次/周,连续24周，胸腺肽al116 mg皮下注射2次/周,两次相隔34d ,结果其显效率为62.15 % ,明显高于单一使用IF1Na2Ib 治疗(显效率为33.13 %)的对照组。两组HBeAg 阴转率分别为78.11 %和33.13 %。HBV2 DNA 阴转率分别为71.18 %和30.10 %。治疗组疗效明显优于对照组,显示联合用

13、药的强大抗病毒活性,是目前治疗慢性乙型肝炎较为理想的方案。4.3 基因工程药物治疗心脑血管疾病余蓉等12通过计算机分子设计,预测了水蛭素12肽通过柔性肽(Gly)3与r2PA 连接形成的融合蛋白的空间结构与功能,并构建了表达该融合蛋白的工程菌,融合蛋白表达后通过复性,得到了分子设计预期的具有较高溶栓抗凝双功能活性的新型蛋白。该研究首次将重组水蛭素HV3的C末端12肽与rPA基因融合,具有作用半衰期更长,选择性更高,抗原性、出血性等副作用更小等特点。体外活性分析证实该工程融合蛋白具有良好的抗凝纤溶双功能,具有成为新一代溶栓药的潜力。余榕捷等13利用PCR方法扩增纳豆激酶酶原基因,并克隆到表达载体

14、上,构建表达pro2NK和载体上22 氨基酸短肽的融合蛋白的表达质粒pENK,表达质粒pENK分别转化溶源化宿主菌内获得表达菌。SDS2PAGE 结果显示两菌株均表达42kD 的目的蛋白。纤维蛋白平板法显示表达产物具溶栓的活性,本研究为开发纳豆激酶成为新一代溶栓药物奠定了基础。4.4 基因工程药物治疗艾滋病艾滋病患者的后期一般会感染上巨细胞病毒性视网膜炎，FAD上市了针对这种病毒的首个反义药物福米韦生，该药是新的反义硫代磷酸脂寡核苷酸，与CMV的MRNA互补碱基链相结合，特异性的抑制CMV的复制，而不干扰人体正常的基因功能。临床用药8天便可观察到边缘浑浊降低，明显延缓了病人CMV视网膜炎的病变

15、14。4.5 基因工程药物治疗其他疾病成骨生长肽(OGP) 是一种促进体外成骨细胞增殖和体内成骨的多肽。利用人工合成的人成骨生长肽基因,与质粒pTYB2 重组,转化大肠杆菌E1coliBL21,经异丙基硫代22D2半乳糖苷诱导,融合蛋白在E1coli中得到表达,经一步亲和层析纯化得到重组人成骨生长肽。体外实验证明rhOGP 对成纤维细胞的增殖有促进作用,体内实验证明rhOGP 加速兔移植骨成活,使血清中碱性磷酸酶活性增高,骨钙素增高。rhOGP促进成骨,有可能成为治疗骨移植及骨折愈合的有效药物15。梁宁生等16将不同浓度的重组PLA2与不同的菌株在37 共同孵育2 h ,然后铺琼脂板,次日记录

16、每一琼脂板上的菌落生成数，计算出PLA2作用后细菌生存率和杀灭95 %细菌的PLA2浓度。结果PLA2对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等革兰阳性菌有较强杀菌作用,PLA2 LD95的范围在6400 ng/mL ,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也有较强的作用,LD95为400 ng/mL 。该研究表明重组人血小板型PLA2对革兰阳菌有较强的杀菌作用,具有发展成为新型抗菌药物的巨大潜力17。5基因工程制药的发展4-8生物工程( bioengineering ) 主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和发酵工程等5个部分。现代生物技术的核心是基因工程，人工进行基因切割、重组

17、、转移和表达的技术。基因工程诞生于70 年代。自1978 年成功地用大肠杆菌生产生长激素释放抑制因子以来, 人胰岛素、人生长激素、胸腺素、干扰素、尿激酶、乙肝病毒疫菌和肿瘤坏死因子等数十种基因工程产品相继问世; 1982年开始进入商品市场, 在疾病防治中获得广泛应用, 并已取得或正在取得巨大的效果和收益。基因工程发展的大事件，1972 年，以H .Boyer，P. Berg 等人为代表的一批美国科学家发展了关于重组DNA 技术。并于1972 年得到了第一个重组的DNA 分子, 1973 完成头一个细菌基因的克隆。1975 年F. Sanger 以及A.Maxam 和w.Gilbert 发明了快

18、速的DNA 序列测定技术。1977年第一个全长5, 387bp 的噬菌体 X174 基因组测定完成。1978 年首次实现了通过大肠杆菌生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1981 年R. D.Palmiter 和R. L.Brinster 成功获得第一个转基因小鼠；A.c.S pradling 和G.M.Rubin 培育出转基因果蝇。1982 年第一个由基因工程菌生产的药物一胰岛素， 在美国和英国获准使用。1988 年J.D.wat son 出任”人类基因组计划” 首席科学家, 协调举世瞩目的人类基因组测序工作的进行。1989 年我国首个基因工程药物IFN- a1 1989 年经卫生部

19、批准获新药证书。1995 年自然杂志汇集发表了人基因组全物理图, 以及3 号、16号和22 号人染色体的高密度物理图。1997 年中国科学院国家基因研究中心以洪国藩教授为首的科学家小组, 在世界上首次成功构建了高分辨的水稻基因组物理图英国爱丁堡罗斯林研究院首次克隆成功多莉羊, 引起世界轰动。6 目前基因工程药物的主要类型9-106.1 干扰素 是哺乳动物细胞在诱导下产生的一种淋巴因子，能够加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用，抑制病毒在细胞内的增殖，用于肿瘤和其他病毒病的治疗。6.2 生长激素 人体生长激素能够治疗侏儒症和促进伤口愈合，动物生长激素能够加速畜禽生长发育 。 目前，人和动物

20、的生长激素基因都已经在大肠杆菌中成功表达， 在医学和畜牧业领域取得了很好的应用效果。6.3 红细胞生成素 是一种肾脏产生的作用于肾髓的造血相关细胞因子，使原始红细胞的成熟期缩短，调节肾髓中的造血细胞含量，用于肾功能不全引起的贫血、放射化疗引起的贫血以及其他一些罕见的贫血症的治疗， 还可用于外科手术前准备自体输血的病人。 红细胞生成素目前是在培养的哺乳动物细胞中表达，但成本较高，生产过程复杂。6.4 白细胞介素 是一种抗肿瘤免疫因子 ，可促进 T 细胞的生长、增殖和分化，也可促进 B 细胞的生长和增殖，同时能够增强杀伤性淋巴细胞的功能，也用于癌症的治疗。6.5 集落刺激因子 分为 2 类： 一类

21、为粒细胞集落刺激因子，另一类为巨噬细胞集落刺激因子。 二者都可促进体内白细胞的增殖，增强粒细胞的功能，调控造血功能，用于肿瘤病人化疗后白细胞下降等的治疗。7基因工程制药技术的应用11-22基因工程技术在医药工业中最重要的应用是新药的研究、开发、生产和改造传统药物。目前，通过基因工程技术已经能够获得以前由于材料来源困难或制造技术问题无法生产的药物，主要有生理活性物质、抗体、疫苗 3 大类。7.1 生理活性物质的生产利用基因工程技术已能够生产激素类药物、细胞因子类药物、重组溶血栓类药物等。如胰岛素、重组人生长激素、重组人促卵泡激素、干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、转化生长

22、因子 B、生长因子、重组链激酶及重组组织型纤维酶原激活剂等。7.2 抗体的生产基因工程抗体又称重组抗体，是指利用重组 DNA 及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗及基础理论研究等领域。自从基因工程抗体技术诞生以来，它的发展经历了好几个阶段。主要包括完整的抗体分子、抗体可变区 Fv、单链抗体ScFv、抗原结合片段Fab以及其它为改善抗体药物的某些性质而产生的各种抗体衍生物。1984年，Morrison等人将鼠单抗可变区与人 IgG恒定区在基因水平上连接在一起，成功构建了第一个基因工程抗体。此

23、后，各种基因工程抗体大量涌现。它们已用于肿瘤、病毒病、自身免疫病、哮喘及心血管疾病等的治疗，如用于治疗B 细胞淋巴瘤的抗 CD20 嵌合抗体 Rituximab，用于治疗自身免疫病的抗TNF- 单抗 Infliximab。7.3 疫苗的生产基因工程疫苗是将病原体的编码保护性抗原的基因片段克隆入表达载体, 用以转染细胞或真核细胞微生物及原核细胞微生物后得到的产物或者将病原的毒力相关基因删除掉, 使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗。其包括基因工程亚单位疫苗、基因缺失活疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗、转基因植物疫苗等。和传统疫苗相比，基因工程疫苗有许多优点：（1）具有可靠的安全性和有效性；（2）

24、易于大规模使用；（3）生产成本低。中国基因工程药物的发展方向及对策结合生物技术的发展趋势和目前市场上基因工程药物的种类分布,我国基因工程药物的发展方向大致如下。(1) 开发针对神经系统、肿瘤、心血管系统、艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋白质和核酸等新生物技术产品。此方面开发重点将主要是干扰素、生长激素与T2PA 等。(2) 选择一批市场前景好的生物技术产品及疫苗、诊断用单克隆抗体进行开发,我国在这方面已有一定基础,开发重点是乙肝基因疫苗与单克隆抗体诊断试剂。(3) 开发靶向药物主要是开发抗肿瘤药物。目前治疗肿瘤药物在杀死癌细胞的同时,也杀死正常细胞。导向治疗就是针对这个问题提出来的,所谓导

25、向治疗就是利用抗体寻找靶标,如同导弹的导航器,把药物准确引入病灶,而不伤及其他组织和细胞。(4) 人源化的单克隆抗体的研究开发。抗体可以对抗各种病原体,亦可作为导向器,但目前的单克隆抗体多为鼠源抗体,注入人体后会产生抗体(抗抗体) 或激发免疫反应。目前国外已研究噬菌体抗体技术、嵌合抗体技术、基因工程抗体技术以解决人源化抗体问题。(5) 血液替代品的研究与开发仍然占重要地位。血液制品是采用大批混合的人体血浆制成的,由于人血难免被各种病原体所污染,如艾滋病病毒及乙肝病毒等,通过输血而使患者感染艾滋病或乙型肝炎的案例时有发生,因此利用基因工程开发血液替代品引人注目18。基因工程药物目前的研究方向是通

26、过关键技术的突破性研究，研发具有自主知识产权，对治疗人类重大疾病能够产生确切的疗效，毒副作用较小，可以进行大型规模化生产，质量较为稳定的、功能可控的基因工程药物，并且在原有基因工程药物的基础上，开发系列制剂，满足不同患者的需求，扩大临床治疗效果和应用范围.基因工程药物的未来的发展方向是将针对危害人类健康的重大疾病（创伤修复、心脑血管疾病治疗、神经系统疾病和肿瘤等方面），在基因工程多肽及基因治疗药物、疫苗、重大疾病防治药物、药物新剂型、分子诊断技术等方面进行突破性的研究和发展，并研制和加大力度开发对老年疾病的治疗，研发能够产生有效作用的新型制剂和特效药物8前景展望23-24生物制药特别是基因工程

27、制药已经是本世纪增长最快的行业， 因其治疗的有效性及安全性， 随着理论研究的深入，分子生物学及基因组学的发展， 未来制药行业， 基因工程药物将占有越来越大的比重。目前， 世界各国都将基因工程及其逐渐加速的产业化进程视为国民经济的新增长点， 展开了激烈的市场竞争。欧美等生物技术先进国家有大批学者从事生物药品与基因产品研究与开发。经过20 多年的发展，我国基因工程制药已取得了可喜的成绩。然而, 我们应清醒的认识到我们与发达国家的差距, 如拥有自主知识产权的品种少， 多为仿制药品等问题。生物制药属于典型的“ 高投入、高风险、高产出、长周期” 行业， 这些特点造就了生物医药企业的发展不平衡。对于目前国

28、内的生物医药企业来说，竞争趋向于新技术与新领域， 因此具备创新能力、拓展融资渠道至关重要。基因工程制药的发展尚需业内各方共同努力，具体如下:1、“ 产、学、研” 相结合， 以医药科研单位为核心， 高等医药院校和综合大学生命科学院及药品生产企业共同参与研究与开发工作。2、重点扶持优势品种， 对有创新及突破的品种政府应给于一定支持。3、 加大科研投入，对分子生物学基因组学基础性研究予以资助，在源头上对基因工程药物的开发加大投入。4、提高生物制品的检验能力，完善科研服务平台， 为企业、院校的产品服务。 参考文献1胡文，陈惠鹏，汤仲明，等.生物制药的现状和未来 （一 ）：历史与现实市场J.中国生物工程

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