柱子的使用与维护

《柱子的使用与维护》由会员分享，可在线阅读，更多相关《柱子的使用与维护（16页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、正相、反相和极性胶联柱使用手册Chrompack HPLC Normal-,Reversed phase and Polar bonded columns注意此色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH7.0）或酸性溶剂（pH6.5）或酸性溶剂（pH6.5）或酸性溶剂（pH2.5）会溶解硅胶材料导致柱子损坏。简介柱填充硅胶基质的强阴离子交换材料，含有季胺功能团。特别设计用于使用常规HPLC分析有机和无机阴离子。色谱柱老化在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。要老化这类柱子，首先要使用甲醇淋洗，然后使用

2、去离子水。再用你选用的洗脱液进行平衡。在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。洗脱液推荐在这类柱上使用的洗脱液要求低电导，或者UV吸收的缓冲液，例如磷酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5。绝对不能使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸分解产物会改变固定相的性质。另外，硝酸铵（1mM）可以改善峰型，而且不会明显影响保留时间，检测或定量结果。洗脱液在使用以前要脱气，并用0.45微米滤膜过滤，防止发生检测和泵送问题。一定要在开始使用系统以前检查有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。流量和压力柱内径（毫米）流速（ml/min）最佳最高2.00.

3、21.03.00.42.04.61.04.010.04.718.0注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi；玻璃柱：3000psi增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。如果你想更换柱子，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。使用保护柱（见第6节）会防止污染物沉积在分析柱上。样品准备保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱，不管是来自流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常

4、困难或者不可能去除。保护柱一定要使用保护柱，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep 柱我们建议使用ChromSep Anion 交换保护柱。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱，我们建议使用Chromguard Anion exchange High Efficiency（高效）柱(10X3.0mm) 或High Capacity（高容量）柱(50X3.0mm)。进样量和浓度柱尺寸长度*内径最大样品体积2502.0mm10l2003.0mm15l2504.6mm50l25010.0mm250l当样品的洗提强度比洗脱液低

5、（在柱样品预浓缩）的时候，更高的样品量也可以注射。温度Chrompack IonoSpher A 柱可以在室温环境使用。为了提高柱子的稳定性，建议不要在40C以上使用。贮存在贮存柱子以前，建议先用去离子水，然后用甲醇冲洗。一定不要在柱子内充满缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下贮存色谱柱。检测灵敏度对于使用邻苯二甲酸缓冲液作为洗脱液的阴离子的检测，以下几种方法可用：折光检测电导检测紫外检测邻苯二甲酸缓冲液对所有三种检测方法都是特别好的，因为邻苯二甲酸缓冲液具有高的折光性，相对低的电导率和紫外吸收性质。检测波长取决于要检测的离子。系统峰当你使用Chrompack IonoSpher A 柱的时候

6、，系统峰可能会出现。通常一个馏分既溶剂在前面，第二个馏分应当是硫酸盐。方向（正峰或负峰）取决于样品的pH。位置取决于流动相的pH。较低pH会使系统峰向前移动。在我们的实验中pH值在3.8-4.3之间最佳。12柱效损失的可能原因额外的峰展宽。要保证管路的长度和内径都保持最小。洗脱的平衡时间不够。不正确的洗脱液pH或洗脱液的离子强度。洗脱液中存在不正确离子。固定相污染。高柱压伴随分辨率降低。颗粒物积聚在烧结物或者填充物床上。样品来源-过滤或离心洗脱液来源-过滤洗脱液，封闭洗脱液容器。系统来源-冲洗整个系统管路和泵；安装在线系统过滤器。蛋白质类物质的积聚微生物在样品中生长。微生物在洗脱液中生长。正常

7、柱压伴随柱效降低有机污染样品中有脂肪，油脂，脂质。固定相的表面被覆盖。从样品中带来的不确切的有机物或未正确制备的洗脱液。在洗脱液制备完成以后带入洗脱液中的非特定有机物，例如在运输时从大气中带来。13.对于纠正污染问题的可能有效的操作准备新鲜的洗脱液在很多情况下，柱效的丧失可以归结为洗脱液的污染。所以，要在使用柱子以前准备新鲜的洗脱液，冲洗所有液体管路。洗脱液应当用0.2到0.4微米的滤膜过滤，在使用以前要脱气。色谱柱再生要进行色谱柱的再生工作首先使色谱柱反向以0.4ml/min的流速用1M硝酸铵洗脱30ml。以0.4ml/min的流速用40：60 （v：v）的甲醇/水洗脱30ml。以0.4ml

8、/min的流速用异丙醇洗脱30ml。以0.4ml/min的流速用水洗脱30ml。以0.4ml/min的流速用洗脱液洗脱30ml。将柱子转回正常方向。用洗脱液平衡。以上内容由美国瓦里安技术中国有限公司北京办事处李华译自Chrompack IonoSpher A 柱随柱附带操作手册。 有机酸分析柱使用手册Chrompack Organic Acids Column注意Chrompack Organic Acids 色谱柱填充的是聚合物材料，需要特殊的维护。向柱内导入以下介绍了的以外的有机溶剂会导致聚合物材料膨胀和过度增压。因此，你应当在安装柱子以前，先用异丙醇，然后用0.1N的硫酸十分彻底地冲洗管

9、路以彻底去除有机溶剂。1 简介Chrompack Organic Acids柱填充有氢形式的阳离子排斥树脂，特别开发用于在低牙条件下分离包括酒、果汁、奶制品、生物样品、工业原料和环境样品中的有机酸。2 洗脱推荐使用浓度范围在0.002到0.05N的稀硫酸溶液。大多数的分析使用0.01N的硫酸（pH=2.3）都可以获得成功。其他的强酸例如磷酸和高氯酸也可以使用，但是卤酸例如盐酸不推荐使用，因为它们会腐蚀不锈钢。当有强酸用于柱子的洗脱液的时候，柱子就进行了自身再生。所以，特别的再生步骤是不需要的。但是这样并不能直接对洗提强度和大多数有机酸的保留性质进行校正，较强的洗提强度通常只减少最后馏出的化合物

10、的保留时间。在使用以前，所有的洗脱液都要用0.45m滤膜过滤和脱气。对于这个柱子，使用有机相修正，例如乙腈（最大20%），可以缩短保留时间。这样做，总是会造成背压的升高。所以，较高的操作温度和较低的洗提流速通常可用于防止产生过高压力。注意，一旦对柱子使用了有机相修正，柱子就会保留使用了有机相修正的洗脱液的色谱特性，即使洗脱液已经恢复到原始的100%的水相，柱子的性质也不会回到当初发货时的状态了。因此，如果你的应用中包括有芳香酸或不饱和酸，它们会出现较长的保留时间，我们推荐使用Chrompack的芳香酸柱（Cat.no.28352），它是专门设计用于此类化合物的。3 流量和压力推荐用于Chrom

11、pack Organic Acids柱的流量是0.3-0.8ml/min。任何情况下洗脱流量都不能超过0.8 ml/min，记住柱子压力产生的原因有洗脱流速，柱温，洗脱液的黏度等等。要限制洗提流速，使泵压力不超过2200PSI。在45C，0.6ml/min流速时，预期的压力应当在600-1500 PSI之间。如果在此条件下，柱压超过了1200 PSI，通常指示有污染物沉积在填充材料上，必须采取改正的措施。（见有关柱效丧失的原因一节）。 4 样品准备保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将脂肪，油脂，蛋白质物质和重金属离子导入色谱柱， 不管是流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒

12、杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。生物样品在注射以前必须除去蛋白质。较好的除蛋白试剂是磺基水杨酸。柱前过滤器柱前过滤器含有0.5-2.0um的多孔不锈钢烧结物，安装在样品注射器和柱子之间用于从洗脱液中去除颗粒物。这样可以防止分析柱产生压力增高的问题，延长柱子的寿命。当有保护柱的时候，柱前过滤器就可以不用了。保护柱保护柱应当用在这个柱上，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高。样品中诸如盐和蛋白质类的污染物可能会使柱效降低，在注射进柱子以前应当去除。5 样品量通常使用的样品量在10-50微升的范围内，但是进样高达100微升应当没有问题。进样500微升或者更多可能

13、会导致峰变宽或者融合。6 温度Chrompack Organic Acids柱可以在20-90C使用。提高柱温会改善柱效。然而，柱温也会样品的保留，所以建议使用柱温箱以保证得到可以重复的结果。由于某些分离对温度非常敏感，所以有必要仔细地操控温度以优化分离效果。如果在室温使用这个柱子，洗脱流速必须降低保持泵压不高于2200PSI。7 贮存柱子提供给你的时候使用0.01N的硫酸作为平衡。这也是建议的用于贮存的洗脱液。柱子在保存的时候，一定要使用提供的螺丝和垫圈将端口密封。色谱柱必须以这种方式使用和保存，在任何时候都要保证不使柱床干涸。不正确的贮存（没有密封）或不正确的使用，会导致填充材料部分地干涸

14、，会发生高的柱压。在这种情形下，可以倒转柱子，要以0.1ml/min的流速在90C向柱子泵入0.01N的硫酸。逐渐增加流速到0.5ml/min。你将会得到正常的压力，柱子将可以用于任意方向。如果这样还不能解决问题，柱子可能有颗粒物或其他物质的污染。8 柱效丧失的可能原因-额外的峰展宽。要保证管路的长度和内径都保持最小。不正确的柱温。不正确的洗脱流速。在开始洗脱的时候，平衡时间不够。洗脱液的pH或离子强度不正确。不正常的阳离子（如Na+或H+）。聚合物污染。-高柱压伴随柱效降低。颗粒物积聚在烧结物或者聚合物床上。样品来源-过滤或离心洗脱液来源-过滤洗脱液，封闭洗脱液容器。系统来源-冲洗整个系统管

15、路和泵；安装在线系统过滤器。蛋白质类物质的积聚微生物在样品中生长。微生物在洗脱液中生长。-正常柱压伴随柱效降低金属离子污染不确切的钢合金存在于系统中。洗脱液含卤素。在制备或者运输过程中洗脱液金属离子污染。有机污染样品中有脂肪，油脂，脂质。聚合物的表面被覆盖。从样品中或者未正确制备的洗脱液中带来的非特定的有机 物。在洗脱液制备完成以后带入洗脱液中的非特定有机物，例如在运输时从大气中带来。-床压缩过高的洗提流速使用了不正确的有机相修正或其浓度过高。9 色谱柱再生使用稀硫酸（或其他强酸），通常这种洗脱液会将被样品组分替换掉的氢离子补充回来而再生柱子。因此，不必要采取特别的再生步骤。用于纠正聚合物污染

16、或聚合物床压缩的可能的操作制备新鲜的洗脱液在很多情况下，柱效的丧失会归结为洗脱液的污染。所以，要在使用柱子以前要制备新鲜的洗脱液，冲洗所有液体管路。洗脱液在使用以前，应当用0.2到0.4微米的滤膜过滤。聚合物床的“放松”如果使用了不正确的高流速的话，很多聚合物与硅胶连接会缺乏硬度而可以被压缩或坍塌。然而，它们是可以回弹的，在很多情况下，压缩是可以恢复的。要修复坍塌的聚合物床，关闭泵，使聚合物放松30分钟。倒转色谱柱，泵入洗脱液，0.1毫升流速，65C淋洗过夜。10 恢复色谱柱的正常条件。倒转色谱柱如果柱效问题依旧存在，可以将柱子倒转，用标准的操作条件在这个反方向操作。如果柱效恢复正常，继续在这

17、样的状态工作。如果没有改善，聚合物也许就永久地污染了而需要更换。如下所述，清洗和再生步骤的关键在某种意义下是从聚合物床上清洗污染物，从而恢复柱效。然而，重要的是在再次使用柱子之前要尝试查找问题的根源。11 色谱柱清洗准备25%乙腈的水溶液。设定柱温为65C，使洗脱液反方向0.1毫升流过色谱柱。然而，不要使柱压超过2200psi，如果必要，调整柱流速，向柱内泵入此溶液4小时（如果污染特别严重，就要过夜）。在正常条件下测试柱子。如果压力恢复到正常，但是分辨率依然很差，就要尝试如下所述的柱再生步骤。如果压力没有恢复正常，柱子也许就永久地损坏了而需要更换。12 色谱柱再生准备含0.05N的硫酸溶液。设

18、定柱温为65C。使柱子反方向，以正常洗提流速泵入此酸溶液。注意观察柱压，不要是柱压超过2200psi，如果必要，调整柱流速。向柱内泵入此溶液2小时（如果污染特别严重，就要过夜）。13 色谱柱的检查将柱温恢复到正常。以正常的流速在正常分析条件下操作，但是要反方向。如果柱效没有恢复，将柱子正方向安装，重复以上步骤。注意可能需要一些时间来使基线稳定。14 色谱柱的更换以上步骤只在某些情况下可以恢复柱效。对于这些处理手段，重金属和某些有机物污染可能无效。在这种情况下，必须更换柱子。明智的做法是在安装新柱子以前，找到问题产生的原因。仔细阅读Chrompack的文件。记住保护柱的使用会延长柱子的寿命以及防

19、止很多污染问题。氨基柱的使用和保养氨基柱是同时可以用于正相条件和反相条件的这一点很多用户都已经知道；但是要注意到的是：正相溶剂和反相溶剂往往是不互溶的，对这一点的忽略可能会带给使用者一些麻烦。 对于新购买到的柱子，首先请注意打开分析测试说明书，了解柱子的保存溶剂。如果保存溶剂与你将要使用的流动相极性不同不会互溶，请先用异丙醇过渡。过渡过程中注意因异丙醇粘度较大，会导致柱压很高，适当调低流速即可。如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，建议在用分析流动相之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。 1.柱效检测：我用于判断一个用户是否有经验的指标之一，是用户是否习惯配制

20、一些柱效检测标准溶液。说到柱效检测，我可以向大家提供一个方法，而且很通用，你也可以用同样的标准溶液和流动相来检测硅胶柱和氰基柱。流动相：10乙酸乙酯90正己烷 流速1.0标准溶液：乙苯（如乙苯找不动就用甲苯代替呗）苯甲酸甲酯检测波长254nm这个方法特别适用于新购柱子（新购柱子往往保存在正相溶剂中）时即进行检测，如有问题，可及时与供应商沟通。也适合在柱子在准备放置相当长一段时间之前进行充分清洗后进行检测作为记录留档。在平常的使用过程中，如果分析物是固定重复的，我们当然可以从对分析物的分离分析情况来作出判断；但如果分析物和分析条件不同时，定期检测柱效可以避免柱效下降导致分离不佳再分析查找原因这样

21、浪费人力物力的过程。不过特别要注意的是，当氨基柱（或氰基柱）在反相条件中使用时，如用该条件检测，请注意流动相的换相过渡问题。 2. 氨基柱的使用：需要注意的是，氨基柱的键合官能团氨丙基要比C18,C8柱的键合官能团C18,C8要容易水解，所以首先要做好其使用寿命稍逊的心理准备，特别是当你的使用条件是反相条件下时。反相条件下使用时，要特别注意控制PH值范围，PH值越低越有发生水解的危险，流动相中水的比例越高当然也越有发生水解的危险。所以，在使用后以及准备长时间放置该柱时，必要的清洗和将氨基柱保存于纯的有机溶剂中是很好的保养措施。 有一种情况是，当使用氨基柱进行酸性物质如果汁的分析时（分析其中的糖

22、份），酸性物质的存在意味着质子的存在，可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。这时，Kromasil专家所给的建议是：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0NH3的50-50乙腈-水溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1。3. 氨基柱的清洗简单说起来，正相条件下使用的氨基柱你就参照硅胶柱的清洗方法；反相条件下使用的氨基柱你就参照C18的清洗方法。平时在正相条件下使用：首先用50倍柱体积的异丙醇清洗，因异丙醇粘度较大可适当放低流速；之后，用50

23、倍的甲醇清洗；之后，用异丙醇过渡回到平常使用的正相流动相，即可。 平时在反相条件下使用：缓冲盐应及时冲洗，以及不能直接用纯甲醇冲洗缓冲盐等，属常识就不作特别交待了。用50倍纯甲醇冲洗；之后，用异丙醇过渡后，用二氯甲烷冲洗色谱柱；之后，再用异丙醇过渡回来到甲醇条件下。 这些清洗方法，主要是针对当样品中有杂质逐步吸附累积到填料上时的处理方法，色谱柱表现行为为诸如柱压增高柱效降低等LUNA氨基柱的使用方法1.氨基柱既可以正相使用，也可以反相使用，但是要注意到的是：正相溶剂和反相溶剂往往是不互溶的，正常情况新氨基柱保存在正相环境中，例如LUNA 氨基柱保存在正己烷-乙腈（99：1）中。2. 正相使用2

24、.1 新柱子可直接用流动相。推荐先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲10倍柱体积，再根据流动相选用极性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速冲10倍柱体积，最后换成流动相。2.2正相使用时，不宜分析含醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动相要彻底脱气，并不得含有羰基化合物和过氧化物（质量不好的乙醚、四氢呋喃含有少量）。2.3 任何时候更换流动相时都要确保新流动相与柱子原保存液可互溶。3 反相使用3.1先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲10倍柱体积，再依次以相同的流速相同的用量用氯仿、异丙醇、甲醇、甲醇-水（50：50）冲柱子。3.2 以0.5ml/m

25、in的流速用30倍柱体积的pH11.0的氢氧化钠（LUNA）水溶液冲柱子（注意pH值切不可超过11.0），立即用水（0.5ml/min的流速，30倍柱体积）冲洗，再换成流动相。3.3 配制流动相时，应各组分分别量取，比例较小的组分要精密量取，需调pH值时要精密到0.1。3.4 反相条件下使用时，要特别注意控制pH值范围，pH值越低越有发生水解的危险，流动相中水的比例越高当然也越有发生水解的危险。最理想的pH范围在pH 3.0-7.03.5如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，建议在用分析流动相之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。3.6有一种情况是，当使用氨基

26、柱进行酸性物质的分析时，酸性物质的存在意味着质子的存在，可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。建议：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1。4 色谱柱的冲洗：简单说起来，正相条件下使用的氨基柱就参照硅胶柱的清洗方法；反相条件下使用的氨基柱就参照C18的清洗方法。5 色谱柱的保存5.1 正相使用时，将柱子冲洗干净后，用正己烷-乙腈（99：1）保存。5.2 反相使用时，如短期不

27、用，可用甲醇或乙腈保存；长期不用时需将甲醇依次用异丙醇、氯仿置换，最后用正己烷保存。6 色谱柱的再生6.1 方案1：依次用甲醇、异丙醇、氯仿、正己烷、氯仿、异丙醇、甲醇冲柱子（各以0.5ml/min的流速，20倍柱体积），再换流动相。这些清洗方法，主要是针对当样品中有杂质逐步吸附累积到填料上时的处理方法，色谱柱表现行为为诸如柱压增高柱效降低等。6.2方案2：NH2柱用于反相条件时，NH2键会水解，尤其是在该柱子pH范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用需要清洗一下，需要用10倍柱体积溶液冲洗，如下：95水/5乙腈THF四氢呋喃95乙腈/5水并保持95乙腈/5水继续冲洗，以低流速0.2-0.5mL/min过夜冲洗。6.3 方案3：柱子使用一定时间后，柱效下降，老化，也可清洗一下柱子恢复柱性能,清洗时依次用10倍柱体积的下列溶液冲洗：95水/5乙腈THF四氢呋喃95乙腈/5水再走流动相即可第 16 页 共 16 页