现代分析技术与应用：第十章 紫外-可见分光光度法

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1、第十章第十章 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 第一节第一节 紫外紫外-可见分光光度法的基本原理可见分光光度法的基本原理一、电子跃迁类型一、电子跃迁类型chhE能级差4. n * 跃迁：跃迁： 含杂原子饱和基团（含杂原子饱和基团（OH，NH2） 150250nm（真空紫外区）（真空紫外区）1. * 跃迁：跃迁：饱和烃（甲烷，乙烷）饱和烃（甲烷，乙烷）1046. 配位场跃迁：在配体存在下过渡元素的配位场跃迁：在配体存在下过渡元素的d或或f轨道中电子从低能轨道中电子从低能态轨道向高能态轨道跃迁态轨道向高能态轨道跃迁 300600nm； max 102末端吸收末端吸收(end absorpti

2、on)(end absorption)肩峰肩峰(shoulder peak)(shoulder peak)吸收峰吸收峰(peak)(peak)谷谷(valley)(valley) 生色团：有机化合物中具有不饱和键和未成对电子，生色团：有机化合物中具有不饱和键和未成对电子，产生产生* 跃迁和跃迁和n*跃迁的基团，即能吸收紫外跃迁的基团，即能吸收紫外-可可见光的基团，如见光的基团，如 CC；CO；CN；NN ；CS 等。等。-可见光可见光生色团相连时生色团相连时1R带：由含杂原子的不饱和基团（带：由含杂原子的不饱和基团（-CO；-CN；-NN-）的）的n *跃迁产生。跃迁产生。 E小，小，max2

3、50400nm，max200nm，max104 共轭体系增长，共轭体系增长，max红移，红移，max3B带：芳香族化合物带：芳香族化合物*跃迁产生的特征吸收带跃迁产生的特征吸收带 max =254nm，宽带，具有精细结构；，宽带，具有精细结构； max=2004E带：由苯环环状共轭系统的带：由苯环环状共轭系统的 *跃迁产生，也是跃迁产生，也是芳香族化合物的特征吸收带芳香族化合物的特征吸收带 E1 180nm max104 （常观察不到）（常观察不到） E2 200nm max=7000 强吸收强吸收5电荷迁移吸收带电荷迁移吸收带6配位场吸收带配位场吸收带一些化合物的电子结构、跃迁和吸收一些化合

4、物的电子结构、跃迁和吸收带见带见p. 185表表10-1四、影响吸收带的因素四、影响吸收带的因素1. 位阻效应位阻效应发色团之间有共轭效应，会使吸收带长移（红移），但发色团之间有共轭效应，会使吸收带长移（红移），但影响共轭的因素会抵消这种效应。影响共轭的因素会抵消这种效应。HHHH max280nm max 10500 max295.5nm max 290002. 跨环效应跨环效应H2COCSO max214nm，248nm max238nm max 25353. 溶剂效应溶剂效应溶剂除影响吸收峰位置外，还影响吸收强度及光谱形溶剂除影响吸收峰位置外，还影响吸收强度及光谱形状，极性溶剂会使峰形变

5、宽，造成精细结构消失。影状，极性溶剂会使峰形变宽，造成精细结构消失。影响吸收峰位置的原因如下响吸收峰位置的原因如下4. 体系体系pH的影响的影响当发色团连有氢离子给予体或接受体时，体系当发色团连有氢离子给予体或接受体时，体系pH会对会对其吸收峰的位置和强度产生影响。其吸收峰的位置和强度产生影响。OHO-OHH+ max 210.5nm，270nm max 235nm，287nm五、朗伯五、朗伯-比尔定律比尔定律EclIIolgI/Io是透光率；是透光率；E为常数，称吸光系数，为常数，称吸光系数，c为浓度，为浓度，l为厚度（光程）为厚度（光程）用用T替换替换I/Io得：得：- -lgT=Ecl又

6、用又用A替换替换- -lgT得：得：A=- -lgT=Ecl，T=10-A=10-EclA为吸光度为吸光度T也称透光率也称透光率在给定单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数是物质在给定单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数是物质的特性常数，是定性和定量的依据。的特性常数，是定性和定量的依据。1. 摩尔吸光系数摩尔吸光系数lCAEA：一定波长时的测定值：一定波长时的测定值c：溶液的浓：溶液的浓度为度为1mol/Ll：厚度为：厚度为1cmc：溶液的浓：溶液的浓度为度为1g/100mL2. 百分吸光系数或称比吸光系数百分吸光系数或称比吸光系数用用 或或EM标记标记用用 表示表示%11 cmE =%111

7、0cmEM六、偏离朗六、偏离朗-比定律的因素比定律的因素朗朗-比比溶液中溶质可因浓度改变溶液中溶质可因浓度改变而发生离解、缔合、溶剂而发生离解、缔合、溶剂作用等，因而出现偏离朗作用等，因而出现偏离朗-比定律的现象。例如：比定律的现象。例如：Cr2O72+2CrO4H2O2H+2若溶液稀释若溶液稀释2倍，倍，Cr2O72-不是减少不是减少2倍，而是受稀释平倍，而是受稀释平衡向右移动的影响，衡向右移动的影响， Cr2O72-离子浓度的减少明显多于离子浓度的减少明显多于2倍，结果偏离朗倍，结果偏离朗-比定律。比定律。朗朗-比比应用的重要前提应用的重要前提入射光为单色光入射光为单色光设入射光由波长为设

8、入射光由波长为 1和和 2的光的光组成，则：组成，则：lECIIlCEIITA10lglg00杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。内，与所选波长相距较远。吸光质点对入射光有散射作用，入射光在吸收池内外界吸光质点对入射光有散射作用，入射光在吸收池内外界面之间通过时又有反射作用。这两种作用都造成正误差。面之间通过时又有反射作用。这两种作用都造成正误差。 质点的散射强度与入射光的四次方成反比；质点的散射强度与入射光的四次方成反比；真溶液散射光弱，可用空白对比补偿；浑浊液散射光真溶液散射光弱，可用空白对比补偿；浑浊液散

9、射光强，不易制备相同白补偿。强，不易制备相同白补偿。反射光可用空白对比补偿，但空白溶液与试样溶液要反射光可用空白对比补偿，但空白溶液与试样溶液要保持一致性。保持一致性。倾斜光通过吸收池的实际光程比垂直光的光程要长，影倾斜光通过吸收池的实际光程比垂直光的光程要长，影响测定值，产生正误差。响测定值，产生正误差。TTlElEAClCETAlg1lgTTTTTTCClg434.0ln.微分后并除以上式得浓度的相对误差微分后并除以上式得浓度的相对误差 C/C ：影响测定结果的相对误差两个因素：影响测定结果的相对误差两个因素：T T和和T T T T影响因素：仪器噪音影响因素：仪器噪音 1 1）暗噪音；）

10、暗噪音；2 2）讯号噪音）讯号噪音1. 暗噪声暗噪声与检测器和放大电路不确切性有关与检测器和放大电路不确切性有关2.讯号噪音讯号噪音与测定光强时的不确切性有关与测定光强时的不确切性有关大多数仪器的大多数仪器的 T在在0.2%1%之间，设为之间，设为0.5%代入代入前式，求出不同吸光值（前式，求出不同吸光值（A）时的浓度相对误差，作图）时的浓度相对误差，作图（图中实线）。（图中实线）。A值在值在0.20.7， C/C 较小，为测量有较小，为测量有效范围。效范围。讯号噪音讯号噪音 T可用下式表示：可用下式表示：K值与光敏值与光敏元件的品质元件的品质和和 有关有关用上式不同吸光值时的浓度相对误用上式

11、不同吸光值时的浓度相对误差，作图（图中虚线）。差，作图（图中虚线）。11TTKT第二节第二节 紫外分光光度计紫外分光光度计 1光源：光源：2单色器：单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件包括狭缝、准直镜、色散元件 棱镜棱镜对不同波长的光折射率不同对不同波长的光折射率不同色散元件色散元件 分出光波长不等距分出光波长不等距 光栅光栅衍射和干涉衍射和干涉 分出光波长等距分出光波长等距钨灯或卤钨灯钨灯或卤钨灯可见光源可见光源 3501000nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯紫外光源紫外光源 200360nm一、主要部件一、主要部件3吸收池：吸收池： 玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区

12、石英石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区区 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）光电池光电池光电管光电管光电倍增管光电倍增管二极管阵列检测器二极管阵列检测器5 5记录装置：讯号处理和显示系统记录装置：讯号处理和显示系统4 4检测器：检测器：将光信号转变为电信号的装置将光信号转变为电信号的装置二、分光光度计的类型和光学性能二、分光光度计的类型和光学性能（一）几种光路类型（一）几种光路类型1单光束分光光度计：单光束分光光度计：特点：特点： 使用时来回拉动吸收池使用时来回拉动吸收池 移动误差移动误差 对光源要求高对光源要求

13、高 比色池配对比色池配对2双光束分光光度计：双光束分光光度计：特点：特点： 不用拉动吸收池，可以减小移动误差不用拉动吸收池，可以减小移动误差 对光源要求不高对光源要求不高 可以自动扫描吸收光谱可以自动扫描吸收光谱3双波长分光光度计双波长分光光度计 特点：特点： 利用吸光度差值定量利用吸光度差值定量 消除干扰和吸收池不匹配引起的误差消除干扰和吸收池不匹配引起的误差4. 光多道二极管阵列检测的分光光度计光多道二极管阵列检测的分光光度计5. 光纤探头式分光光度计光纤探头式分光光度计特点：特点： 光路简单，误差、干扰小光路简单，误差、干扰小 可快速获得全光光谱可快速获得全光光谱特点：特点： 仪器安装简

14、易，仪器安装简易，无需吸收池无需吸收池 操作灵活，检测快速操作灵活，检测快速（二）光学性能（二）光学性能1. 波长范围波长范围仪器能测量波长范围：仪器能测量波长范围：1901100nm2. 波长准确度波长准确度仪器显示的波长数值与单色光的实际仪器显示的波长数值与单色光的实际 波长值之间的误差：波长值之间的误差：0.3nm3. 波长重现性波长重现性重复使用同一波长，单色光实际波长重复使用同一波长，单色光实际波长 的变动值：的变动值： 0.3nm4. 透光率测量范围透光率测量范围仪器能测量透光率范围：仪器能测量透光率范围： 0300%（T）5. 吸光率测量范围吸光率测量范围仪器能测量吸光率范围：仪

15、器能测量吸光率范围： -0.4773.0（A）6. 光度准确度光度准确度以透光率测量值的误差表示。透光率以透光率测量值的误差表示。透光率 满量程误差为满量程误差为0.3%（NBS900或或 铬酸钾溶液）铬酸钾溶液）（三）仪器的校正（三）仪器的校正7. 光度重复性光度重复性同样情况下重复测量透光率的变动性：同样情况下重复测量透光率的变动性： 0.3%8. 分辨率分辨率单色器分辨两条靠近的谱线的能力。单色器分辨两条靠近的谱线的能力。 260nm处为处为=0.3nm9. 杂散光杂散光通常以测光讯号较弱的波长处所含杂散光。通常以测光讯号较弱的波长处所含杂散光。 的强度百分比为指标的强度百分比为指标22

16、0nm处处NaI(1%g/ml) 0.1%1. 波长校正波长校正2. 吸光度的校正吸光度的校正3. 吸收池的校正（配对）吸收池的校正（配对）通过特定光源的谱线或材料、通过特定光源的谱线或材料、化合物的特征吸收峰化合物的特征吸收峰特定化合物的的标准溶液特定化合物的的标准溶液第三节第三节 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法一、定性分析一、定性分析 吸收光谱的特征吸收光谱的特征 吸收光谱的形状吸收光谱的形状 吸收峰的数目吸收峰的数目 吸收峰的位置（波长）吸收峰的位置（波长） 吸收峰的强度吸收峰的强度 相应的吸光系数相应的吸光系数 max、 （ ）%11 cmE定性鉴别的依据定性鉴别的依据CCH3

17、CH3CH3CH3OOCCH3OO安宫黄体酮安宫黄体酮CH3OOHCCH炔诺酮炔诺酮 max=240nm1nm%11 cmE= 408 max=240nm1nm%11 cmE= 5712. 对比吸光度（吸光系数）的比值对比吸光度（吸光系数）的比值 A=Ecl A1/A2=E1cl/E2cl=E1/E2例如维生素例如维生素B12的鉴别：的鉴别：药典规定药典规定A361nm/A278nm比值为比值为1.701.88A360nm/A550nm比值为比值为3.153.45。361nm550nm278nm二、纯度检查二、纯度检查1. 杂质检查杂质检查2. 杂质的限量检测杂质的限量检测2）化合物强吸收，杂

18、质无吸收）化合物强吸收，杂质无吸收/弱吸收弱吸收与纯品比较，与纯品比较，E；主成有分吸收，杂质强吸收；主成有分吸收，杂质强吸收与纯品比较，与纯品比较，E，光谱变形。光谱变形。1）化合物无吸收，杂质有吸收）化合物无吸收，杂质有吸收直接考察杂质含量。直接考察杂质含量。用用0.05M的的HCl溶液制成样品为溶液制成样品为2mg/mL的溶液，规定的溶液，规定 310nm下测下测定定A3100.05。例：肾上腺素中肾上腺酮微量杂例：肾上腺素中肾上腺酮微量杂质含量计算。质含量计算。 =435%11 cmE%06. 01002101 . 1%/101 . 1100/101 . 1143505. 0334%1

19、1肾上腺酮mlmgmlglEACcm即杂质的含量小于等于即杂质的含量小于等于0.06%三、单组分的定量方法三、单组分的定量方法lEAC 选择在选择在吸收峰处，有几个吸收峰时，吸收峰处，有几个吸收峰时，选选无杂质干扰的无杂质干扰的较高的吸收峰处。较高的吸收峰处。选择溶剂时，溶剂在选择溶剂时，溶剂在吸收峰处无吸收（见表吸收峰处无吸收（见表10-3） E通常来源于标准数据（通常来源于标准数据（ max 的的 或或 ），简单。），简单。如不能在如不能在 max处测定处测定A，则须测定标样，则须测定标样在在 处的处的E值。值。%11 cmE 测定测定E值的仪器与工作仪器不是同一台时，误差不容值的仪器与工

20、作仪器不是同一台时，误差不容忽视。忽视。同一台仪器上工作，固定测试条件，有：同一台仪器上工作，固定测试条件，有：A=K c，浓度与吸收度呈线性关系，浓度与吸收度呈线性关系样样同上条件固定条件查得测定样品曲线分别测定配制标准系列过程：CAACAmLmgmLmLmLmg250 . 32550/200. 0样品标样分别移取（三）对照法（三）对照法同一台仪器（误差小）上工作，固定测试条件，则：同一台仪器（误差小）上工作，固定测试条件，则：标样标样标样标样AACCAACC应用：一元弱酸应用：一元弱酸HA离解平衡常数的测定离解平衡常数的测定在高酸性（或高碱性）溶液中：在高酸性（或高碱性）溶液中： 或或AA

21、-= cA-A= cHAHA溶液酸度在两者之间时：溶液酸度在两者之间时：根据吸光度的加和性，则：根据吸光度的加和性，则：=HAAHA+A-A-HAH+A-+Ka=cHAHA=H+H+Kac=cA-A-=H+Kac KaH+Kac Ka=HA+H+H+KacA-AHAH+KaKa=+H+H+KaA-AAHAKa=+H+H+KaA-AAHAAKa =-H+A-AA -例：测定维生素例：测定维生素B6的的pKa值值 称取称取VB625mg，溶于水后稀释至，溶于水后稀释至100ml，作为贮液。供，作为贮液。供试液按下表制备成试液按下表制备成pH各不相同但含各不相同但含B6浓度相同的溶液。浓度相同的溶液

22、。VB6在在pH2时为酸式体，在时为酸式体，在pH7时为碱式体。时为碱式体。将溶液将溶液A（酸式体）和溶液（酸式体）和溶液E（碱式体）分别置于（碱式体）分别置于1cm吸收池中，在吸收池中，在230375nm波长范围内扫描。重叠两个吸波长范围内扫描。重叠两个吸收光谱，选择适当的测定波长，收光谱，选择适当的测定波长，溶液VB6贮液V(ml)0.1mol/mLHCl V(ml)0.05mol/mLNaAc V(ml)pH7磷酸盐缓冲液V(ml)V总A 10.010.000100.0B10.06250100.0C10.04250100.0D10.02250100.0E10.00050100.0四、同时

23、测定多组分的定量方法四、同时测定多组分的定量方法计算分光光度法计算分光光度法1两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分吸收光谱不重叠（互不干扰） 两组分可在互不重叠下选择两组分可在互不重叠下选择测定测定A，分别按单组分定，分别按单组分定量。量。2两组分吸收光谱部分重叠两组分吸收光谱部分重叠 1测测A1b组分不干扰组分不干扰可按单组分定量测可按单组分定量测Ca 2测测a组分干扰组分干扰bbaabaCECEAAA22222baabECEAC2223两组分吸收光谱完全重叠两组分吸收光谱完全重叠混合样品测定混合样品测定（1）解线性方程组法）解线性方程组法bbaabaCECEAAA11111bbaabaC

24、ECEAAA22222bababbaEEEEEAEAC12211221babaaabEEEEEAEAC122121122等吸收双波长法等吸收双波长法消除消除a的影响测的影响测b选选 的等吸收点，得的等吸收点，得 和和aA1aA2bA2同理：同理：aaaaEEAAEAC2121消除消除b的影响测的影响测abaAAA111 AbaAAA222AbabbaaAAAAAAAAA)()(212121AAAaaAA21)(21bbbAAAAAbbbbbCEECEA)(21AbbbbEEAAEAC2121AAAA1A2五、紫外吸收光谱用于有机化合物分子结构研究五、紫外吸收光谱用于有机化合物分子结构研究（一）

25、有机化合物的紫外吸收光谱（一）有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱特征取决于：分子中的生有机化合物的紫外吸收光谱特征取决于：分子中的生色团、助色团、共轭情况。色团、助色团、共轭情况。单纯的紫外光谱不能确定化合物的结构，必须与单纯的紫外光谱不能确定化合物的结构，必须与IR、MS、NMR相配合，但可以用来推定分子的骨架、判相配合，但可以用来推定分子的骨架、判断生色团之间的共轭关系、估计共轭体系中取代基的断生色团之间的共轭关系、估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目。种类、位置和数目。1. 饱和碳氢化合物：饱和碳氢化合物： * 跃迁，跃迁，150nm（远紫（远紫外区），在紫外吸收光谱中常

26、用作溶剂。外区），在紫外吸收光谱中常用作溶剂。2. 含孤立助色团和生色团的有机化合物含孤立助色团和生色团的有机化合物： * 跃迁，吸收峰红移。跃迁，吸收峰红移。生生色团：色团： *跃迁；杂原子双键：跃迁；杂原子双键： *、 n*、 n*跃迁。跃迁。3. 共轭烯烃：两个孤立双键吸收峰位置与单个双键吸共轭烯烃：两个孤立双键吸收峰位置与单个双键吸收峰位置相同，吸收强度约增加收峰位置相同，吸收强度约增加1倍；倍；共轭双键，降低共轭双键，降低与与*能级差，吸收峰长移。共轭体能级差，吸收峰长移。共轭体系增加，系增加， 到到*跃迁所需能量减小，吸收峰长移增加，跃迁所需能量减小，吸收峰长移增加， 增大，化合物

27、由无色逐渐变为有色。增大，化合物由无色逐渐变为有色。4. ,不饱和酮、醛、酸和酯不饱和酮、醛、酸和酯： *，由由200nm长移长移至至200-260nm; n *,由由280nm长移至长移至310-350nm。羧酸和酯的羰基碳直接连接助色团，共轭作用下，羧酸和酯的羰基碳直接连接助色团，共轭作用下， 和和*轨道能级均升高，但成键升高更大，使得吸收峰轨道能级均升高，但成键升高更大，使得吸收峰长移；长移；n轨道能级未变，轨道能级未变，n *吸收峰短移。吸收峰短移。5.芳香族化合物：芳香族化合物：（1）苯和取代苯：苯：）苯和取代苯：苯：E1、E2、B三个吸收带。三个吸收带。B带带是芳香化合物特征；取代

28、苯：三个带都长移，是芳香化合物特征；取代苯：三个带都长移， 增大。增大。芳环有生色团取代时，出现芳环有生色团取代时，出现K带；苯甲醛等，带；苯甲醛等，K、B、R带。带。（2）芳杂环化合物：）芳杂环化合物：五元不饱和杂环化合物：呋喃、噻吩、吡咯，无五元不饱和杂环化合物：呋喃、噻吩、吡咯，无n *跃迁；六元氮芳杂环，如吡啶，有跃迁；六元氮芳杂环，如吡啶，有n *跃迁。跃迁。（二）有机化合物结构的研究：（二）有机化合物结构的研究：1.从吸收光谱中初步推断基团：从吸收光谱中初步推断基团：210-250nm，可能含有，可能含有两个共轭单位；两个共轭单位；260-300nm，3-5个共轭单位；个共轭单位；

29、 250-300nm弱吸收，羰基存在；弱吸收，羰基存在；250-300nm中等强度吸收，中等强度吸收，苯环存在；化合物有颜色，分子中共轭生色团一般在苯环存在；化合物有颜色，分子中共轭生色团一般在5个以上。个以上。2.异构体的推定：异构体的推定：（1）结构异构体：如松香酸和左旋松香酸。）结构异构体：如松香酸和左旋松香酸。（2）顺反异构体：如顺反）顺反异构体：如顺反1，2-二苯乙烯。二苯乙烯。3.化合物骨架的推定：化合物骨架的推定：未知化合物与已知化合物的未知化合物与已知化合物的UV一致时，可以认为两者一致时，可以认为两者具有同样的生色团。具有同样的生色团。六、比色法六、比色法可见分光光度法可见分

30、光光度法使无吸收的物质转变为有色物质，便于测定。使无吸收的物质转变为有色物质，便于测定。（一）显色反应及其条件（一）显色反应及其条件1. 对显色反应的要求对显色反应的要求 显色反应必须是定量的；显色反应必须是定量的； 反应的有色产物必须有反应的有色产物必须有足够的稳定性；足够的稳定性； 产物与试剂的最大吸收峰必须有足产物与试剂的最大吸收峰必须有足够的差别；够的差别； 产物的产物的 值必须足够大（值必须足够大（103105）；）； 显色反应显色反应必须有较好的选择性。必须有较好的选择性。2. 反应的条件反应的条件必须通过实验确定显色反应的最适宜条件，须注意：必须通过实验确定显色反应的最适宜条件，须注意： 试剂用量对产物组成的影响试剂用量对产物组成的影响 溶剂对产物吸收峰的影响溶剂对产物吸收峰的影响 酸碱度对产物组成和吸收峰的影响酸碱度对产物组成和吸收峰的影响