食品中的霉菌检测方法

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1、中 文 摘 要摘 要随着社会经济的高速发展，食品安全问题日益受到公众的关注，提出灵敏性高、快速高效的检测方法，对于食品中霉菌的精确检测和控制是至关重要的一项任务。食品中的霉菌毒素的毒副作用较大，造成的食品污染通常具有无法避免及分布不均匀等特点，严重影响消费者的健康安全。本文首先对食品中主要霉菌毒素的结构及理化性质进行介绍，进而介绍现有的霉菌毒素检测方法，主要从物理检测、免疫学检测及其他方法三大类进行描述。但由于不同的检测方法存在不同的检测精度和准确度，因此在实际应用中，应当根据检测霉菌种类、样品的实际情况及检测环境条件等因素，科学选择对应的检测方法，保证食品中霉菌检测的准确性与可靠性。关键词：

2、食品安全；霉菌毒素；检测方法目 录摘 要- 1 -1 前言12 霉菌毒素12.1霉菌毒素的定义及分类12.2霉菌毒素的结构及理化性质12.3霉菌毒素的危害22.4 食品中主要霉菌毒素分析32.3.1黄曲霉毒素32.3.2黄变米毒素32.3.3镰刀菌毒素32.3.4赭曲霉毒素42.3.5展青霉毒素42.3.6青霉酸毒素42.3.7交链孢霉毒素42.3.8杂色曲霉毒素43 霉菌检测方法63.1 物理检测方法63.1.1平板培养法63.1.2近红外光谱法73.1.3气相色谱法73.1.4高效液相色谱法73.1.5薄层层析法83.2 免疫学方法83.2.1荧光免疫法83.2.2胶体金技术93.2.3酶

3、联免疫法93.3 其它检测方法103.3.1适配体芯片技术103.3.2 生物传感器法11结 论12参 考 文 献13食品中的霉菌检测方法1 前言随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，食品安全问题层出不穷，严重制约着经济的稳定发展及公众的健康安全，同时人们对食品安全的重视程度也与日俱增。保障食品安全已经是刻不容缓的任务，但食品安全问题十分庞杂，而食品霉菌污染仅仅是其中的一个方面。农产品上的残留农药、动物的残留兽药加工过程的生物毒素及各种添加剂、防腐剂都是导致食品污染的重要原因。其中生物毒素对食品污染的影响十分重要。生物毒素并未人工合成的结果，而是天然形成的，其种类十分多样，但到目前为止仅法向

4、两千多种毒素的化学结构。依据毒素的不同来源，生物毒素可分为动植物毒素和微生物毒素。在生物毒素当中，微生物毒素占据绝大部分，占据生物毒素种类的大部分，根据污染方式又可分为霉菌毒素和细菌毒素。霉菌毒素是霉菌的二级代谢物，其不仅会污染食品的引起中毒，甚至导致细胞癌变。霉菌毒素引起的食品污染已经引起社会的普遍关注，据调查显示，世界上大约有1/4以上食品存在霉菌污染现象，使得霉菌的监管工作尤为重要。霉菌的监管主要是霉菌的检测，因此，合适的霉菌毒素检测方法对保障食品安全意义重大。本文着重阐述了食品中霉菌毒素种类、危害和目前现有的检测方法。-13 -2 霉菌毒素2.1霉菌毒素的定义及分类霉菌是广泛分在在自然

5、界的一种真菌。大多数种类的霉菌都会引起事物的霉变，霉变过程中不同的生长环境导致仓储霉菌和田间霉菌两类霉菌的生成。其中仓储霉菌大部分为曲霉菌属，而青霉菌属和镰刀菌属在田间霉菌中也处于绝大部分。霉菌毒素作为霉菌的二级代谢产物，现有已知的霉菌种类多达300种，根据产生毒素的种类分为曲霉菌毒素、青霉菌毒素和镰刀菌毒素。根据生长环境，这些毒素种类又可归并为田间毒素和仓储毒素。其中在田间毒素类中，较为常见的毒素主要为玉米赤霉烯酮、伏马毒素及呕吐毒等。而属于仓储毒素的黄曲霉毒素和青霉菌毒素比较常见。霉菌毒素的分布较为广泛，在土壤和动植物体中均存在一定的分布。因此在食品污染中，霉菌毒素的污染范围也很大。黄曲霉

6、素不但主要存在于花生、大米等作物上而且还是导致肉类和乳制品污染的主要因素。而玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦等谷物产品；另外杂色曲霉毒素很容易污染粮食作物；展青霉素主要存在于污染的水果产品中。 2.2霉菌毒素的结构及理化性质霉菌毒素的结构各异，可分为刚性共面苯环结构、部分共面结构和无共面的倍半萜烯结构。不同的结构必然存在不同的理化性质，直接体现在吸附性上。其中，刚性共面苯环结构毒素具有较强的吸附性，部分共面结构的毒素次之，而无共面的倍半萜烯结构毒素的吸附性能最差。尽管霉菌毒素的吸附性能差异较大，但大部分霉菌毒素和有机化合物都存在相似的理化性质。大多数霉菌毒素都是以化学性质稳定的固体存在自然界，并

7、且大都具有强烈的毒性特征，目前毒性最强的是黄曲霉毒素B1。 2.3霉菌毒素的危害霉菌毒素不但对人类有直接危害，还可间接的通过人体摄入的各种食物对人类健康产生危害。霉菌毒素严重危害人体的健康，不仅仅表现为中毒症状，还会破坏人体免疫系统、使得细胞癌变畸形，从而导致人体免疫能力下降，抵抗力变弱甚至患癌。不同的霉菌毒素存在不同的理化性质，存在不同的危害性。短期内单一霉菌毒素的危害可能并不严重，但当多种霉菌毒素共同作用于人体组织时，会造成多个器官功能衰竭，引发严重的后果。霉菌毒素主要对人和动物体内的肠、胃、肝、脾、肾等器官危害较大，并会在一定程度上损伤神经系统。研究结果表明，霉菌毒素能够和靶细胞中的DN

8、A和RNA相结合，破坏其机体所需蛋白质的合成过程，抑制了细胞的免疫作用，进而导致机体免疫功能退化，甚至消失。同时霉菌毒素还会作用于淋巴细胞，抑制淋巴细胞的生成，破坏淋巴组织的免疫功能。常见霉菌毒素对人体的危害及靶器官，如表1所示。表1 霉菌毒素的危害霉菌毒素危害黄曲霉毒素靶器官是肝脏，致使肝脂肪变性、全身性出血、消化机能障碍和神经系统紊乱玉米赤霉烯酮相关性激素代谢紊乱赭曲霉毒素 A肾脏是第一靶器官，肾小管变性和机能损伤呕吐毒素以呕吐、消化道损伤为特征T-2 毒素细胞毒性，使免疫细胞功能下降，引起贫血、出血烟曲霉毒素呼吸道损伤、细胞病变展青霉素导致神经、呼吸和泌尿等系统的损害，使人神经麻痹、肺水

9、肿、肾功能衰竭杂色曲霉毒素肝肾等器官坏死，细胞毒性2.4 食品中主要霉菌毒素分析2.3.1黄曲霉毒素黄曲霉和寄生曲霉的代谢过程可以产生黄曲霉毒素，其中黄曲霉是部分产毒的，而寄生曲霉代谢的黄曲霉毒素均是有毒的。根据在动物体内不同的代谢产物，可将黄曲霉毒素分为P1、G1、G2、M1、M2、B1、B2等，其中黄曲霉毒素B1 的毒性最高，是最具危险性的致癌物，其毒性大约为氰化钾的100倍以上，略低于肉毒毒素，最敏感的动物是雏鸭，表现为肝脏毒。黄曲霉毒素主要作用于粮油制品中，其中花生、玉米及其制品的污染成都最严重，且温度和湿度较高的地区污染更为严重。2.3.2黄变米毒素使正常大米变质失去原有颜色并出现黄

10、色的毒素变为黄变米毒素，主要分为岛青霉毒素、黄绿青霉和桔青霉三种。岛青霉毒素污染的米粒呈黄褐色溃疡性病斑，主要作用于肝脏；黄绿青霉黄变米的米粒呈淡黄色病斑，主要通过其产生的神经毒素，引起神经麻痹，最终导致呼吸衰竭甚至死亡。但该毒素不耐高温温度超过300摄氏度其毒性就会完全消失。而桔青霉毒素黄变米的米粒为黄绿色，主要作用于人和动物的肾脏器官。2.3.3镰刀菌毒素镰刀菌毒素是镰刀菌的代谢物，广泛分在自然界各个角落。镰刀菌毒素种类十分复杂，其中玉米赤霉烯酮、单端孢霉毒素和伏马菌素较为常见。镰刀菌毒素很容易污染动植物，对人类健康的威胁巨大。部分种类的镰刀菌长期存活在粮食各种作物中，比如玉米赤霉烯酮，一

11、旦食用含有该毒素的食品立马会出现呕吐、腹泻等症状。糙米中则很容被杂色曲霉素感染，该毒素有很强的致癌性，误食后极易引发人体肝肾等器官衰竭，从而对人体造成危害。而单端孢霉素不但耐高温且活性持久。即使在贮藏多年的谷物中，其毒力依然很强。2.3.4赭曲霉毒素与黄曲霉毒素相比，赭曲霉毒素的毒性相对略弱，但其在农产品中的分布却远远大于黄曲霉毒素。赭曲霉毒素通常由纯绿青霉、赭曲霉和碳黑曲霉等代谢产生。该毒素主要污染谷物和肉类食品，同样严重破坏机体的肝脏和肾脏功能。人类若食用被感染的肉制品后，会导致消化功能紊乱，肾功能受损甚至衰竭死亡。 2.3.5展青霉毒素这种毒素主要源于扩展青霉、寻麻青霉、棒曲霉等产毒真菌

12、。该毒素具有急性和亚急性的毒性，啮齿类动物中毒症状通常表现为痉挛、肺出血、死亡等；还具有致癌、致畸和致突变性，但研究发现其对鼠并没有致癌、致畸现象，但对鸡胚存在明显的致畸作用。尽管此毒素对免疫系统有影响，但此过程是可逆的。该毒素主要存在于麦秆中，主要污染水果及水果制品。2.3.6青霉酸毒素青霉酸毒素多是由多种霉菌共同产生的，其中以软毛青霉、棕曲霉以及圆弧曲霉等霉菌的产生为主。该毒素的危害主要表现在影响生育、致癌和免疫三方面。其对人体的危害也很大，直接影响呼机体的呼吸和泌尿等系统的机能，产生神经麻痹和肾功能衰竭等症状。但该毒素只能存在与低温环境中，所以在日常使用的低温保存的食品中更为常见。2.3

13、.7交链孢霉毒素交链孢霉是比较常见的腐生菌，主要包括交链孢霉毒素，交链孢霉甲基醚，交链孢霉酚、细偶氮酸、交链孢霉烯等五种。交链孢霉毒素大都存在于水果蔬菜中，是导致水果蔬菜污染的重要因素。该毒素的的危害主要表现为能够引起动物内部器官癌变畸形，并会导致胃肠道破裂出血，甚至死亡。2.3.8杂色曲霉毒素杂色曲霉毒素的产生主要源于杂色曲霉和构巢曲霉等霉菌，此曲霉毒素具有低水溶性和强致癌性的特点。该曲霉毒素对动物皮肤及肝、肾和肺器官存在较强的致癌作用，其致癌特性略低于黄曲霉毒素。在日常生活中，杂色曲霉毒素也十分常见。如糙米十分容易收到杂色曲霉素的污染，如果对受污染的糙米进行处理形成标二米，此时食品中的曲霉

14、毒素量将显著降低，但长期食用仍然存在致癌风险。3 霉菌检测方法霉菌毒素的测定方法主要包括两种：一是在自然发生中毒情况后对病理分析发现霉菌毒素，如黄曲霉毒素；二是直接研究某种霉菌的性能时，发现其具有毒性，比如在研究赭曲霉的过程中发现了赭曲霉毒素的存在。目前霉菌毒素的检测方法可以概括为物理化学检测方法和免疫学方法，以及新技术联合应用的霉菌毒素检测方法。3.1 物理检测方法物理检测法是霉菌检测中比较常用的方法，主要有色谱法以及近红外光谱法和气相色谱等多种方法。而且随着人类科学的进步，结合现代科技的检测方法越来越广泛的被应用。这些方法的具有高效、精准的优势，在霉菌的检测过程中发挥了巨大的优势作用。3.

15、1.1平板培养法平板培养是食品中霉菌检测的主要方法，该检测方法采用人工形态学观察的方法计算菌落数量。平板培养法操作首先对待测样品稀释处理，使得样品表面的微生物分散为单个孢子，然后将稀释后的样品放入培养基中，在合适的环境下进行培养，并观察每个孢子的生长过程，直至每个孢子都形成宏观的菌落。由于一个单菌落可代表稀释前的一个单细胞，故而根据样品的稀释倍数就能算出原来的菌落数量。因为实际操作过程中，待测样品并不能够分散成单个的孢子，所以最终计算出的菌落个数并不准确。由以上的分析可知，通过该方法来计算菌落个数不够精确，为了改善平板菌落计数法的检测精度，往往采用菌落形成单位来计算菌落数，避免了以绝对菌落数计

16、算样品活菌含量带来检测精度低的问题。实际生活中，在食品检验、生物制品检验以及饮料和水等含菌指数或污染度检测中，平板培养法均被广泛应用。该法的优点在于能够提取活菌的相关信息，缺点是操作较繁，培养周期较长，效率相对低下。而且培养过程中对环境因素依赖较大，实验结果不易控制。并且需要经过复杂的预处理和繁琐的检测过程，无法实现现场快速检测。该方法无法达到食品检验中快速、简单、易于实现的要求。3.1.2近红外光谱法 目前在霉菌检测领域应用最多的就是近红外光谱法，其成功的广泛应用在食品、化工等领域。检验过程中，通过近红外光谱仪扫描样品的得到近红外光谱，能够检测出食品中是否含有霉菌及其含量的大小。又入在使用近

17、红外光谱检测小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，通过近红外光谱将受污染的小麦经稀释校正后，得到样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇等霉菌毒素。整个过程中，不需要对样品进行处理，同时可以进行分组实验，方便、快速、高效、准确且成本较低。该方法是目前应用最为广泛的一种检测方法。缺点是该法需要预先建立准确的校正模型，适用于多次重复性质量控制分析。3.1.3气相色谱法尽管气相色谱法存在分离速度快、分离效果好、灵敏度高等优点，但是只能局限于检测挥发性强和热稳定性好的物质。而大多霉菌毒素的热稳定性较差，不适合采用气相色谱法。因此气相色谱对霉菌毒素的检测存在一定的局限性，通常适用于镰刀菌毒素和展青霉素等。在气相色谱法适用范围内

18、，大量学者进行检测研究。李楠等通过三氟醋酸酐衍生呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、二醋酸交草镰刀菌烯醇和T-2毒素，并利用气相色谱法进行测定，研究发现其衍生物能够实现完全分离。国外学者Tartery等也通过衍生方法对展青霉素进行测定。 3.1.4高效液相色谱法高效液相色谱法与气相色谱法均属于色谱法，但液相色谱法是以液体作为流动介质，利用较高的压差，将不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相输送至设有固定相的色谱柱，同时在色谱柱内实现样品成分的分离，再进行毒素检测分析。高效液相色谱法几乎能够将任何物质进行分离、分析。因此被广泛的应用在工业、农学、医学等领域，甚至在司法检验上应用都很广泛。该法

19、具有分离效果好、分析速度快且柱子可反复使用等优点。但缺点是灵敏度不及气相色谱法、试剂用量较大大和色谱柱等耗材费用高。在食品霉菌检测过程中，高效液相色谱法可对样品的分析定性和定量化，且有多种与之配套的萃取、提纯技术。还可以根据不同的样品选择不同的测试柱，是目前最常用的霉菌检测方法。3.1.5薄层层析法薄层层析法本质为一种混合物分离技术。首先在作为固定相的薄片状玻璃、塑胶或铝箔纸上铺设一层吸附剂；然后将样品稀释并滴在吸附剂上。借助于毛细作用力，滴在固定相上的溶剂混合物会不断往上移动。由于不同物质移动的速度也大不相同，从而实现分离目的。这种分离技术可适用于快速分离生物碱、氨基酸、等多种化学物质的，并

20、且由于该法所用的材料普通，实验过程简单，至今仍然在大多数地区广泛应用。我国的国家标准已经规定，薄层层析法可作为检测食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和饲料中玉米赤霉烯酮及苹果汁中展青霉素的基本检测方法。但该法的缺点是灵敏度差、专一性较差且检测周期长。3.2 免疫学方法免疫学检测方法主要是基于抗体与抗原或半抗原之间的选择性为基础所建立的。其主要用于医药生物中抗体与抗原的检测。一般可分为荧光免疫法、胶金体技术和酶联免疫学法三种。其中酶联免疫法和胶体技术在检测饲料中的霉菌毒素上有很广泛的应用。3.2.1荧光免疫法荧光免疫法是指抗体被荧光物质所标记之后，通过相应的仪器设备来测定抗体的荧光强度，从而

21、得出被检测物体的浓度的方法。该方法的优点是该技术的特异性强、灵敏度高、检测速度快。而另一种检测方法时间分辨荧光免疫法，它是一种则是用了稀土离子来对被测物进行标记，并通过用时间分辨荧光仪来测定产物中的荧光强度，进而推算出被测物的浓度，其灵敏度可达10-19。目前，我国已经有一套较为完整的AFB-TRFIA检测平台，该平台在霉菌的检测过程中具有较高的稳定性，且灵敏度达0.0039g/L，线性范围在0.0039100g/L。另外美国AOAC的标准检测方法中，荧光检测法也常常结合免疫亲和柱使用，而我国在进出口检验检疫行业标准中也用此法检测黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等，因为荧光免疫计法经济、实用，且不需要

22、使用霉菌毒素的标准品，因此荧光免疫法在快速检测中意义重大。3.2.2胶体金技术免疫胶体金技术是一种新型的免疫标记技术，它主要以胶体金作为示踪标志物作用于抗原抗体的，并在还原剂的作用下形成某一粒径的颗粒，然后颗粒在静电场力作用下形成胶体状态，即胶体金。弱碱环境能够促进胶体金与蛋白质分子的紧密结合，而且并不会改变蛋白质本身的特性。除了此项特点外，胶金体还具有一些特殊的物理性质，故而其在免疫学、组织学等细胞生物领域有广泛的应用。胶体金技术是以胶体金免疫技术和新材料膜为基础上而发展起来的新分析方法。该技术具有易操作性、特异性，并且该技术可以和探针技术和层析技术相结合，在食品检测中具有重要的作用。其优点

23、是操作性和特异性好。但在实际应用过程中也同样存在检测灵敏度不高、检测范围扩大等问题。3.2.3酶联免疫法酶联免疫法检测技术主要是在免疫酶技术的基础上得以发展的，是目前最新的检测方法之一。其工作原理是通过酶的连接是使抗原或抗体成为酶标抗原或抗体，并保留其活性。在测定过程中，依据测定步骤，将测定样本和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体相互作用。然后进行洗涤，使反应后的复合物与杂质分离。由于酶反应后底物会呈现为有色物质，同时结合固相载体表面的酶量与样品中测定物质的量间的比例，便可根据颜色深浅激昂分析结果定性或定量化。再加上酶本身的的催化率高，更使得测定方法具有较高的灵敏度。目前，在对黄曲霉毒素

24、的测定上，酶联免疫法大多采用商品化试剂盒，试剂盒的灵敏度大都在0.5ppb，实际检测限一般为5 ppb。ELISA方法的检测性能很大程度上依赖于抗体的性能。随着抗体性能的提高和酶联免疫法的改进，黄曲霉毒素的检测精确度也进一步提高。 酶联免疫法虽然操作简单，但抗原抗体制备过程复杂，且仅针对单一类型毒素的检测，检测所用商品化试剂盒不能重复使用，试剂盒价格也较高。且实际操作过程中需要多次洗涤，影响结果的重现性。3.3 其它检测方法随着生物技术的不断深入研究与革新，部分新技术逐渐与常规霉菌毒素检测方法相结合，进而开发出新型检测技术。目前主要包括适配体生物芯片技术和生物传感器等新型检测方法。3.3.1适

25、配体芯片技术适配体是利用指数富集系统进化筛选获得的寡核苷酸系列，能够识别靶细胞的特异性，并转换为三维结构与靶细胞紧密结合，进而检测靶物质的含量。适配体的体外筛选过程，主要指模拟自然进化过程，人工筛选寡核苷酸序列（DNA或RNA片段），筛选过程为：寡核苷酸库与靶分子联合孵育，已结合的寡核苷酸复合物与未结合用PCR进行扩增，不断进行循环重复筛选，获得具有强亲和力的单链DNA或RNA分子。适配体传感器需要具备高选择性、高灵敏度、靶分子范围广、稳定性好等特点。适配体的靶分子范围十分广，包括离子、核苷酸、肽链、病毒细胞、霉菌毒素等。适配体具有较高的灵敏度，能够识别几个碱基区别的靶分子，例如适配体能够准确

26、区分只有一个碱基差别的咖啡因和茶碱。同时适配体需要能够和其余相关新技术或药物进行联合使用。适配体能够在体外短周期内完成筛选。适配体能够抑制接收有诱导分子识别的受体，阻断其间的信号传递过程，或者适配体可以与调节信号基因结合，进而抑制病菌的生长。适配体具有能抵抗变性、长半衰期、易经人工添加各种修饰、亲和力强等特点。适配体技术结合现有分析手段，已在医学快速检测中得以广泛应用，在食品检测领域也存在很好的应用前景。相关学者已经将适配体技术应用于霉菌毒素的检测。如Lise Barthelmebs利用适配体酶联技术对红酒中的赫曲霉毒素进行检测；汪立平结合色谱法，实现了霉菌毒素的快速检测；Annalisa D

27、e Girolamo将适配体作为萃取剂，对赭曲霉毒素浓度进行高效液相色谱法检测。同时由于适配体是人工合成的，便于修饰剪辑，比抗体更适合作为生物传感器的识别元件，拓展生物传感器的检测范围与灵敏度，如Laura Bonel研究了DNA适配体在生物传感器中检测应用。3.3.2 生物传感器法高特异性和灵敏度使得生物传感器适用于多组分复杂体系样品的检测及连续重复分析样品，故在食品行业得以广泛的应用。传感器特有的感知元件是一种具备分子识别能力的生物活性物质，在识别范围内能够感知到被监测量，转化为传感器识别的信号，再经过相关信号转换设备转化为定量的数据。目前被广泛应用的感知器件主要为酶、微生物及细胞组织物等

28、活性物质。根据不同的测定方法，生物传感器可以分为电化学型、光学型和超敏感型等传感器。与普通检测方法类似，生物传感器法也有主要的应用场合，目前此方法主要用于液态食品中赫曲霉菌素的检测。结论结 论随着社会的高速发展，食品安全问题日益受到公众的关注，提出灵敏性高、快速高效的检测方法，对于食品中霉菌的精确检测和控制是至关重要的一项任务。食品中的霉菌毒素往往以天然成分的形态存在，很难被直接检测，且潜在的毒副作用较大，霉菌毒素造成的食品污染通常具有无法避免及分布不均匀等特点，长期食用将严重侵害消费者的安全权益，甚至对食品的进出口交易产生恶性影响。本文首先对食品中主要霉菌毒素的结构及理化性质进行介绍，进而介

29、绍现有的霉菌毒素检测方法，主要从物理检测、免疫学检测及其他方法三大类进行描述。但由于不同的检测方法存在不同的检测精度和准确度，因此在实际应用中，应当根据检测霉菌种类、样品的实际情况及检测环境条件等因素，科学选择对应的检测方法，保证食品中霉菌检测的准确性与可靠性。科学技术的发展使得霉菌毒素的种类及危害性不断被发现，不断冲击着现有的检测技术的检测范围及检测精度，对检测技术提出了更高的要求。因此，我们应该深入学习免疫学、分子生物学等知识，找出霉菌毒素的呈现机理，进一步改进现有检测技术，研制出更加简捷、高效和灵敏的新型检测方法，保障食品安全及消费者的安全权益。致谢参 考 文 献1 常东亮. 关于食品安

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