PCR引物流程设计详解

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1、PCR 引物设计流程详解本文目的:复制出 IL-4 基因片段一、查找基因序列1、进入 NCBI 主页,下拉选框选择 Nucleotide,在搜索栏输入要查找的目的基 因,即 IL-4,点击搜索2、在搜索结果选择灵长类(Homo sapiens)2、在灵长类 IL-4 基因中选择需要的 mRN/序列3、查看基因的相关信息1Z2/e&riH_syaDtiyn=-BCCF-1; 3CCF3. B2?-J, E3F1. :L-T /na4:E-ULihl etIEILJCira4r/ dtj rf- GnE;=丽丿朮_吐已仁Et歐噫血厂/dt_lref=UilHli: UL . .JdC雄泌护POh1

2、471 BOf外显子区域exonL.2 00/gena=IL4*fgene_3ynan.yn=*rBCCrF- 1 ; BCGF1 ; BSF- 1 ; BSF1 ;工L4/inf Bience=alignment ;Splign.; L 30! &ewort20L. . 248nniiaiR saiirv/gene= IL4/gene_syiionyn=KGF-l: 2CGFL; ESFT; DS:F 1: lL-4ff/inf e rence= al i grin&nt: Slign: i 3S. S*eKori249. 425/gene= IL4/eene.syncmynCGF-l :

3、BCGFL: BSF-1: BSF 1 : IL-4 /infTrerce= al i gnjuent: Si)lign: 1 30 3ewcn426. . 618/gerie= IL4*/gene_synarLyni=ffECCF-l: CGF1; EST-1: BSF 1: IL-4/inf er cnce=,Tal icrunent; Sjlign; l 3日吕八nw WFWTnmypp mgnm iwrm z1 540 4p i耿筝DIIA if如&QilriMI3-1 ClS*n9*r*匚蚯:T 专JJpncfr刊a Jnl二(11巳也 沖口p iriear!=辻黑疋T震 如mH f

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5、4ft/nate=isof dtm 1precursorisMicodedbytrat.scrilVat j.autI .BCell gi.ov+ii f-attOL1, B_Cellit iitinlal. otyfactor Ilywiphocyte stinulator factor I: binft+rsiin piti.akitira.intctLcukn 4Viti niit 2*/codoiLSt3rt=1iiktB tluiik4laufci.JK1 pre cut 口上 */rrot*iiLid=怔怔时闰帥. / 曲二wf-GI:4 504兀 b/dh /Tef=ffCCrS

6、rLnSdl8. :,T/db_sicr-ffjBHBLD:2nC2,/db zTef=CKCri5OLJr/dti xiBr-pHPFD:0Q3E/ dh_/Tef=FrM!凶空TA ranslaiioi HGU詢LLFFLFFILAJ:AGNFVHEHK灯I TLiH I IK TLNSLT EGK TLCTELT7TD IFAkSK JII TEEETFCRlATiTLIQFYSHHEErTRfLGATiQQFHRHEQ L RFLERLDRWLWLAGLlfSCPVKEQ ZTLEIFLERLKT IffEEtYSEC S営ORIGIN1 t gcat cgt + itC C3+ g

7、itaat tgee t cucat 1. cactgc aa.t cgacacc6Jl agt at at at a gaatetaaaa aaaaaiaaaa aaaiaaaaai4、点击 FASTA 格式,并将序列保存到文档NCDlH lo NUCOtltHomo sapliiLS. Iiitenleukin 4 (IL4h IriiisGrlpt variant九mRNAMite(HBDI-WSllngTcGen-BsnfcChong* rv-gian s-l*iwn应番1Custamtza:vlw-fid皿问IXFIXITCCBTijrn: 7皿LLftBENdLJhUfiTTTLF

8、jo( (xmFfJBBEI1HfldKrEPEEEKEAimpfliTmxl.0OWML?1 MUUILMIMm罪EL*JJaf-LMaki Lri*i-HE iMdc 4. 11 L TartBlEsa xxrl Q iut taiVMdl.PfUfc4*rt. BiptctlhUil.CfiTfFftilHi ftmUillM-. Bw.E ffew” 1 MH IUBJUTIdkrxn lyl LhEtuplr (GTn E3ja*Li C ird K-K41IU R.5,liHlfCLM iUKliHMiii hC*r41llfrl串旳#LATIM 3 I1TIp E-jys rpi

9、uLXi nlh riucptih iJ.3Jt7 tv knsv ariapuhE elaJ匸十5TM irr4仲傅1jnnn 5TEj71HaE|rilXOH. F*itL X UEC-lip 11313LLVJt3 kM Q Zt E lot hr B.T 3J M, B EwkTid-a名2曲仙R. C4 44ZLki( . &lu K Jl 1, VtfW h囂 9 IMM LdJXK:3VtXaa XH.LK1.Y Ed*EAIU* -iHk H3l.h. p bL fW E J XU;M XL-4鼻ruaE* #il*申BLAST1*1唱常”fiRTUflir NvurisFin

10、4 in仙q.fnr或AMbcli-s abcki: ttM IU p ni*Ifjftilh或輪如th甲 薛曲ffij avi_Kpri】面叩Ti m V Clion Rif* 2a 3ii ?Cll4|吕学齐:胡duiSjcn A 1用辺巴54弹INiCfr-al ) SflITP护冲 CM|fe faXI1I|AHLKWHI* gflwlK swinti n M anfIL4A.LH!iah mill ItM Wwi卜:,山上flh-iin富MJ|9MHl5AWhi卜心曲力血r|Lmit 4d旳noMiSJ*l3CMnf rrgiwi thewn*Homo sap福胸inferleuki

11、n 4 (IL4K transcriptvarMnt 1,mRNANiTSIRer&rrct SeB_3xnpxurIXTIBEUBIJEun 4 :L41、r LrmR xirmt .KHUM1TC.TT#;2id:CAC皿皿gz-汨工:口工阮祐总曲他口3厂牯TTT貳肪低阳+常-MmJiTiMwTTn-TnJUjUmjrijr-irTCaCEjGH心二匚3】lXTCTCi:TC%Jb2:心二gjJiXi/JLO:阳 丄 皿 :TTC riCCuXCTjui. -;AT-M;AJ5i*.MTATKr-TT占 ; EMT占TTnMTTTE# TTUT州TMJCITXlTTTTmilTJmTirJ

12、hTlJTThTlJOmnLiJdJimTJJALUTCTgJLLUWJJJLl MJiftMAUJljMvienGIMBMiUV Th* M ffn *ASdliRQT同血F of MOhChiJl AfthffiR Wflh时摘眄)宙|iSUJT5Auiri Ihir 2a 3i. 3VM| igalhcAft uBKirilDe aF riaikuktM4110 irtn 3 JR?円打砂廿i圧f wiy Tor Eh L4 gnnAJegrjft鸥edi!lrA+iiflfr如怦i10O|二、使用 primer premier 5.0设计引物1、建立新文件,将所得的序列复制进输入框内2

13、、点击搜索按钮,搜索引物SEjj2?Norm |FoundFoundFoundFoundFound201to190bpOKancel2 HolpMast Stable Hairpin:AG = 0-& ntulsjfflflfl |iHJif pintr2T?CGArirACGT S T;IIIL3GTGATAAA33 ACGTiS-ZAATCGAAGGGACTATTT 51I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I IrrGCATCCt TASCT T Zt id CATAAAit AAT rZAC A*2 TC AtT&AAT CAC AC

14、 CT At TAAT SKIZlCAcCr CCCA 3RatbipLengthAGkuliAiwIActivityLIJODTa Opt3、设置引物设计参数(因为在之前查找基因序列的时候获知,外显子区域分别为:1-200、201-248、249-425、426-618,又知在引物设计时引物位置最好 跨越一个内含子,PCR 产物长度通常为 100-150bp,故设定上游引物位置为201-248,下游引物位置为 249-425,产物长度为 100-150bp)Primer PremierSenseAnthsenstDirect Select:SResutsProduictSenseAnti-s

15、enseHairpinDimerFalsePriminaCrossDimerPrimnM Eiit0Primers40.0ManualSens e PrimenAnthsense Primer;Se-arch Mode:f* AutomaticPCR Product Size:Search ParamelersSearch Criteria4Searcli Fr:PC R PrimersSequencing Primers1 fj MybridiEation ProbesSearch Type;L Sense PrimerC Compatible with Sense Primer广 Anti

16、 sense PrimerGompdtitle with Anti-sense PrimerL Both(T PairsPnmer Length:9Searcn C rite riaSearch For:* PC Fl PrimersHybridizaton ProbesSearch Type:Sense PrimerAnti serine PriBethSearch Ranges:Sense PrimertAnti-$nse Primer2491PCR Product琦琦UMOKSequencing Primersrirneranual4、确认条件后,显示搜索结果Search Progres

17、sSearch Complete.Primer Search Results:Total Possible145790|HTm1301叵叵GCi049画画| Deg&neracy00凰了阳凰了阳SWilrty1A69|Hj GC ClampG9G画画RedLindncyGE?30_ Re peals/Run aQ1B DimeriHaiirpin927|團團| False PrimingQ叵叵Optimal Primers5Hemainin中口ajec tedSnse:Antisense:Stringency;mV&rv High凰High口ModerateLow回Very Low回Manua

18、lPrimer Pairs:n Pairs Found9Search Results*Rating溜Product|5i“La OplNark193噩 14755 J 1M?60.35&.0149MJ厂厂SS4E2.953,01455X6r4fl452.951.6111两 4厂543.410S50 点厂4、双击选中得分最高的引物查看引物情况rtflFFrimsrzEE RilriSelecr,pwn fcund.Prwliml T.Q簞fQMAA3!|JtrJ 1 L JftrL ULrJu JCC 3 * i ii miiifliimii ii ill iL n-npriiTrw*GC%A.

19、GDflerHncjrT(3pt阿WmMhO-Mm轴厂1JT214M.t(1.1301-PKriyawW.1MlSIJVCidst ftrharpA叭f3 Cimaw口mrjftmprPrwfijiigCkwB Pinwff3P | Nuntf| Nuiifl| Ml FrjilillidlABH-VHI*| HOM| Nune| KuneJ=.-5KJP俺MJ厂1fl*MUD144S:.r=n4B4ifjfi14TELZJDL0sa-B1!-W1JfD4ltoq外!13BlaESSTC TSfi - Bfl- E-STTBGXV?!IhrtbMiivtiRuIsngMTm EACAodvih

20、i1|LT&uf4-riifAoyTH01 rqiisrt&fl!mMi話.E.-1S.1BillAirti-ierisem3F2IV$1.1-J.3J4J1一PrrtlfclK-Hr上w,1HiMMnwPlimimgCress I闻叶$吸塚Onrw D*Eflr:L Jjfl a -U11lemeMontMOMIF i undL1匚1IWWT ! IUC1 U4;L 3-PC 21111-1T DTT -TT . ?T - - -HoneMOIIP|NDI1a |I- 15、将设计的上下游引物复制出来,保存到文档中三、使用 oligo 6.0 对设计的引物进行评价1、建立新文件,将从 cnk

21、i 上获得的 cDNA 复制进输入框,并点击 accept 接收2、接收后显示出该序列的相关信息fll- EdA-.hCti|l丹荷5*皿邛 E *严 怙 卜卒 啊扌 豐呷臂潛哥帘怖别豐7卩/2|匚ducdaai&ac:g 洱0年M-iPr .B_ . j =! = -.1 _JlIa 179、分析 PCR 整体情况叫刖 S塞咄W峠(W邨呻打uiwi口inc Snvch.QEAEBor ueiMliifa li弓 ri m PiJbClwrTi BoAfluy3wch岂*!Iir E匚ELhAl Rcbai Ju li皿匕Aifcwnatfii TiMi片HSFVWIR輯1 CiMMHIE合哄

22、h删仙 Gam3、在输入框内输入模板序列和上下游引物,并设定对比数据库,点击 get primer 进行对比wwvei%NCB1EIREAfl Databases *Swr*口MQWC. Lhi 4叩Pw P ib 匚EHw Ei客樺nlgEr rftpain皿口用珂&irnc* md H卄 却 麺血np cr ia tanm*dcrii Pu=kis jndifsriiiXflsnCUIfl&日晒血CM A API*Get:StaEHHrlHMVJK&I叩mnh.gc阳PCR TT-ewlalt匸呻曰空兰U .M孕STXzquEcg丁色nst訂d:#LMffHl.ikJB*如咸叱TITmM.

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25、nm席SJtaMV fiiu in 1婭W wrdMh N uu Xa.g “4、查看 blast 结果taaunc4 4T1Tipi|q wiMBiv-cHop Tm QC%1* cmitmtnliniv*lir r dii rn.Hi.rwvAWWpl*7AATUTTT7DTGCC-O:-PIE2022f?-45 5B ?1 55 DC 4M0 0DHve*rMCTGC.HGTdCClGiTGGAMrtwIB3?2B0.6D fll.tl3 00OODPrHuet ItngEHUTEiMiiEf W NPro-adcts on intended uretWWW4P4 ixtuninerTe

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