研究生基因分子生物学课程

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1、1二二 分子克隆中常用的其它酶分子克隆中常用的其它酶使用好工具酶应注意：使用好工具酶应注意：1保持反应混合液中蛋白质的浓度不小于0.1mg/ml, 对维持酶在反应混合液中的稳定性十分重要。牛血清白蛋白（组分V是一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质，它的使用终浓度应为0.1mg/ml。2提供合适浓度的底物，酶反应才能有效地进行。应尽量使反应在接近Km（使酶活性达最大值的一半时的底物浓度的条件下进行。3应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度及离子浓度。2（一（一DNA聚合酶聚合酶最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有：大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段（Klen

2、ow片段T4和T7噬菌体DNA聚合酶（来源于T4和T7噬菌体感染的大肠 杆菌经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶热稳定D NA 依赖性 DNA聚合酶反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶33Substrates required for DNA synthesis4Diagram of the mechanism of DNA synthesis5Illustration of the path of the template DNA through the DNApolymerase6Base tautomers7Proofreading exonucleasesremo

3、ves bases from the3 end of mismatched DNA8外切核酸酶的校对工作方式就像电脑键盘上的“delete key”,只纠正最近的一个错误。这种校对功能极大地增加了DNA合成的准确性。DNA聚合酶掺入错误碱基的几率1/105外切核酸酶的校对功能降低了掺入错误碱基的几率1/107事实上一个细胞中发生突变的几率1/101091大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I（全酶（全酶：由单一多肽链组成（Mr约103 000），由大肠杆菌polA基因编码，可通过三个明确的功能域执行三种酶反应。结构域活性生化功能羧基端结构域（543928位，约46kDa)53DNA聚合酶将dN

4、TP的单核苷酸残基加到RNA或DNA引物的3羟基端。这些末端由双链DNA中的切口或裂缝以及与单链DNA分子碱基配对的RNA或DNA短片断组成。中间结构域（336542位，约22kDa)35外切核酸酶切割3羟基端的核苷酸残基，产生3凹端氨基端结构域（1325位）53外切核酸酶碱基配对的5端寡核苷酸的切割10具有3种活性：5 DNA聚合酶活性5 及 外切核酸酶活性主要用途用切口平移方法标记DNA，在所有聚合酶中 只有大肠杆菌DNA聚合酶 I能用于此反应，因为它具有 5外切核酸酶活性，可以在聚合酶沿DNA链推进之 前，从DNA链上去除核苷酸。 还可用于cDNA第二链的置换合成及对带有3突出尾的 DN

5、A分子进行末端标记。11 5 3 3 5 Mg2+ DNase I 5 3 5 3 5 3 3 5 3 5 dATP dCTP 大肠杆菌DNA聚合酶I dGTP (全酶 dTTP 5 3 3 5 5 3 3 5 在镁离子存在下，用低限量的DNA酶 I处理双链DNA，产生的切口可作为大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶催化DNA合成的引物。合成过程中，dNTP不断掺入到正在增长的DNA链上，同时利用全酶的5外切核酸酶活性使切口沿5 方向平移。122 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I大片段（大片段（Klenow片段：片段：用枯草芽孢杆菌蛋白酶温和处理后，DNA聚合酶I可被切割成两个片断：较大的片断

6、（包含326928位残基）称为Klenow片断，执行DNA聚合酶和3 5外切核酸酶活性。全酶的5 3 外切核酸酶活性存在于较小的氨基端片断（1325位残基）。主要用途1补平限制酶切割DNA产生的3凹端，可用 32PdNTP进行DNA片段末端标记。 2在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链。 3用于DNA测序以及聚合酶链式反应。13 示例： p Cp Cp GOH 3 3 Gp Gp Cp Tp Ap Cp Gp Ap 5 Mg2+ 大肠杆菌DNA dNTP 聚合酶 I Klenow 片段 5p C p C p G pA pTp Gp CpTOH 3Gp Gp Cp Tp Ap Cp Gp A

7、p5 用 Klenow DNA聚合酶补平DNA片断的3凹端注：标记反应中含有三种为标记的dNTP及一种标记的dNTP，根据DNA末端的序列进行选择。143 T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶：聚合酶：(来源于噬菌体感染的大肠杆菌）特点是具有很强的35外切核酸酶的活性，比 Klenow片段强200倍，对单链DNA的作用比对双链DNA更强。主要用途1对于带有3突出端的DNA分子进行标记，首 选T4噬菌体DNA聚合酶。首先利用35外 切核酸酶活性切除DNA 3突出尾，产生3凹 端，然后在高浓度的某一种放射性标记的dNTP 存在下，外切降解反应与dNTP掺入3端的反 应达到平衡。 2将双链DNA的末端转化成

8、平端。15示例 ： 5p A p C p T p G p C p AOH 3 Tp G p 5 Mg2+ -32PdCTP T4噬菌体DNA聚合酶 5p A p C 3OH 3Tp G p 5 5p A p C OH3 3Tp G p 5外切核酸酶活性DNA聚合酶活性*165 33 5EcoRIBamHI3 5外切酶活性 32PdNTP T4噬菌体DNA聚合酶 5 3 3 5聚合反应 5 3 3 5限制性消化 BamHI EcoRI 5 3 3 5 通过凝胶电泳纯化链特异性探针 EcoRIBamHI链特异性杂交探针的生成174 T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶：聚合酶：特点是所催化的合成的DNA平

9、均长度要比其他DNA聚合酶催化合成的DNA的平均长度大得多，在用于Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列时，具有很大的优势。T7噬菌体DNA聚合酶的35外切核酸酶活性也很强，约为大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段的1000倍。没有53外切核酸酶活性。主要用途用于拷贝长段摸板的引物延伸反应。185 热稳定热稳定 DNA依赖性依赖性 DNA聚合酶：聚合酶：第一个被发现的热稳定DNA聚合酶是从极度嗜热的栖热水生菌中纯化而来的，其中最早分离出来的一个是Taq DNA聚合酶。Taq基因编码一个823个氨基酸的蛋白，Mr=93.3kDaI II III A B C D E 3 5外切酶结构域 聚合

10、酶结构域 5 3外切酶结构域 DNA结合区1 928大肠杆菌DNA聚合酶ITaq DNA聚合酶 83219Taq和它的衍生物是耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有依赖于聚合作用的53外切核酸酶活性，它的3 5外切核酸酶结构域无催化活性，因此缺乏校正功能。其热稳定性是由该酶核心区的高度疏水性、静电作用力的稳定性、与溶剂分子的相互作用以及酶分子表面的脯氨酸引起的。最佳作用温度为 7580，于60时聚合酶活性仅剩1/2, 于37时活性仅剩1/10主要用途可用于对DNA进行测序，及通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增20 热稳定热稳定DNA聚合酶的特点聚合酶的特点 酶酶 厂家厂家 最

11、佳温度最佳温度 外切核酸外切核酸 错误率错误率 稳定性（在特定稳定性（在特定 酶活性酶活性 10-6 温度的时间温度的时间 Taq BM,Pro 7580 53 20100 97.5时时9min Strat,P-E rTth BM,P-E 7580 53 -20 95时时20min Tfl Pro 70 无无 100 70时时120min Deep Vent NEB 7080 35 2045 100时时480min Pfu Strat 7278 35 1.6 95时时240min 216 反转录酶（依赖于反转录酶（依赖于RNA的的DNA聚合酶）聚合酶） 两种反转录酶：来自纯化的禽源成髓细胞瘤病

12、毒（AMV）；能表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV)反转录酶基因的大肠杆菌中分离得到的。 AMV Mo-MLV结构 两条多肽链 Mr 84kDa的单链多肽RNaseH 活性很强 较弱反应温度 42 42迅速失活，突变体 可在50反应pH 8.3 7.6 22主要用途用于将mRNA转录成双链cDNA。在此反应中可用3种引物：a.寡核苷酸脱氧胸苷1218聚体oligo (dT)12 18。 合成时，模板3端的序列有可能被过量拷贝，从而在 cDNA中所占比例过大，这取决于反转录酶的质量及 反应条件。b. 随机序列的寡核苷酸。 旨在使用序列极为多样的一个寡核苷酸集群，以期至 少能有一

13、些寡核苷酸与模板退火并作为反转录的引物。c.特定序列的寡核苷酸，作为合成与某一段特定的mRNA 相对应的cDNA的引物。2324First strand synthesisSecond strand synthesis25【注】反转录酶与大肠杆菌DNA聚合酶I不同之处是不具有35 外切核酸酶活性，缺乏校对功能，因此容易出错，在高浓 度dNTP和Mn2+存在下，大约每500个碱基会出现一个碱基 的错误掺入。267 末端脱氧核苷酸转移酶：末端脱氧核苷酸转移酶：末端转移酶来源于小牛胸腺，是仅存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNT

14、P加于DNA分子的3羟基端。受体DNA可短至3个核苷酸。此酶强烈偏向于以带3突出端的DNA作为受体，也能在含有Co2+、Mg2+或Mn2+的低离子强度缓冲液中以带3平端或3凹端的DNA作为受体，但效率相对较低 27主要用途给载体或cDNA加上互补的同聚尾 单链DNAOH Mn2+或 Mg2+ dATP, dTTP 末端转移酶 dGTP, dCTP DNA-(pdN)n+nPPi28（二依赖于（二依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶 SP6噬菌体及噬菌体及T7和和T3噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶(来源于SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌LT2株，T7或T3噬菌体感染的大肠杆菌）识别双链DNA模板上

15、相应的噬菌体特异性的启动子，并沿此双链DNA模板起始RNA合成。三种RNA聚合酶都对其相应的启动子呈现高度的特异性，能合成任何置于适当启动子控制下的DNA的全长转录物29主要用途1）用于在体外合成大量与外源DNA一条链互 补的单链RNA，可作为杂交用探针、体外翻译 系统中的功能性mRNA。302）已用T7噬菌体转录系统在大肠杆菌、酵母中表达克隆化基因。将靶基因克隆于噬菌体启动子序列的下游及适当转录终止序列的上游。再将所产生的重组质粒（第一质粒）导入含有以可调控方式表达噬菌体RNA聚合酶的第二个质粒的细胞。因而，诱导聚合酶基因可导致第一个质粒中靶DNA的转录及其所编码产物随后的充分表达。T7噬菌

16、体RNA聚合酶和启动子是大肠杆菌中应用最广泛的二元表达系统。31（三连接酶、激酶及磷酸酶（三连接酶、激酶及磷酸酶包括： T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶 （已不常用） T4噬菌体RNA连接酶 T4噬菌体多核苷酸激酶 碱性磷酸酶321 T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 :由T4噬菌体的基因30编码，是487个氨基酸组成的单体蛋白（Mr=55 230)。催化相邻的核苷酸分子间5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。用途1连接带匹配粘端的DNA分子。 2是平端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相 连接。【注】i 聚乙二醇（PEG可增强水溶液中大分子间的有效 作用, 可促进DNA的分子间连

17、接，提高连接效率。 ii 连接反应中需要ATP 33失去磷酸二酯键的缺口 3 5缺失核苷酸的缺口连接酶封闭缺口 连接酶无法封闭缺口 无活性 (a) (b) (a)具有 3OH和 5P基团的一个缺口被 DNA连接酶封闭起来(b)如果是缺失一个或数个核苷酸的缺口，DNA连接酶则不能将它封闭DNA连接酶的活性连接酶的活性3435Cloning in a plasmid vector36DNA片段之间的拼接方法片段之间的拼接方法1 同种限制性内切酶产物之间的连接：同种限制性内切酶产物之间的连接：同一种限制酶酶切产物之间的末端是互补的，因此可以是正方向，也可以是反方向插入载体，为防止载体自身环化，常用碱

18、性磷酸酶（CIP处理线性的载体DNA分子，移去其末端的5磷酸基团，使其不能再被连接酶共价连接。相同的两种限制酶双切处理的载体与目的DNA的连接是定向的，称为定向连接。37碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化分子再环化38外源外源DNA片段定向克隆片段定向克隆392 产生相同末端结构的不同限制酶切产物之间的连接：产生相同末端结构的不同限制酶切产物之间的连接：同尾酶处理的目的基因和载体之间进行连接，但连接后，原来的酶切位点都丧失。3 平末端平末端DNA片段连接：片段连接：平端可用T4 DNA连接酶连接，其连接效率比粘端之间的连接效率要低，但因平端

19、连接具有普适性，故极其有用。40连接酶的活性单位连接酶的活性单位Weiss单位规定，37下 20 min内可使1nmol 32P在有机焦磷酸于ATP之间产生交换所需的酶量为1个活性单位供货商多使用的是“随意”单位，其依据是连接酶连接DNA粘性末端的能力。粗略估计：1个Weiss活性单位约等于60个DNA粘性末端单位（New England Biolabs公司定义）。因此，0.015Weiss单位的T4 噬菌体DNA连接酶在16下30min内可使50%的用HindIII消化5g 噬菌体DNA所产生的片段得以连接。41连接反应的一般原则连接反应的一般原则为获得最大效率的连接，反应体系越小越好，一般

20、为10l。连接反应中，载体和插入的目的片段的摩尔比一般为1:1或 1:3。DNA 终浓度约为10ng/l。先用琼脂糖凝胶电泳检查 DNA样品的大概浓度，然后计算DNA的用量。 ng of vectorkb size of insert insert kb size of vector vectormolar ratio of =ng of insert举例：500bp目的片段，100 ng 3.0kb的质粒载体，载体与片段用1:3摩尔比 100 ng of vector 0.5kb insert 3 3.0kb vector 1 =50ng of insert42连接反应的温度是影响连接效果的

21、另一个重要因素， DNA片段间的连接常采用较低温度（1216和 较长的时间（1224小时，目的是维持片段粘性 末端间的氢键，便于连接酶的作用。432 T4噬菌体多核苷酸激酶：噬菌体多核苷酸激酶：（来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌）催化ATP的磷酸基转移至DNA或RNA的5末端。在正向反应中，ATP的-磷酸基被转移到去磷酸化的DNA的5端。在交换反应中，过量的ATP存在时，也可将磷酸化的DNA的5端磷酸转移给ADP，然后DNA从-32PATP中获得放射性标记的磷酸而重新磷酸化。该酶催化5突出端磷酸化的速度比催化平端或5凹端快得多，在双链DNA切口或缺口处进行磷酸化的效率比单链末端的磷酸化效率要低。

22、*44用途用途1标记DNA 5末端。 示例： 5 pCp GpC+过量ATP -32PATP T4噬菌体多核苷 二硫苏糖醇 酸激酶 Mg2+ 5 p Cp GpC+ADP 2对准备用于连接但缺乏5磷酸的DNA或合 成接头进行磷酸化。 示例： 5 HOCp GpC ATP T4噬菌体多核苷 二硫苏糖醇 酸激酶 Mg2+ 5 p Cp GpC+ADP *453 碱性磷酸酶：碱性磷酸酶：细菌碱性磷酸酶（BAP和牛小肠碱性磷酸酶（CIP均能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5磷酸的反应。用途用途1在用-32PATP标记5末端前，去除DNA或RNA 的5磷酸。 2去除DNA片段5磷酸，所产生的

23、5羟基不再参 与连接反应，以防止载体分子的自身环化。 3）作为非放射性系统中的报道酶，与配体偶联， 如能与生物素化靶分子特异性相互作用的链亲 和素偶联，可用于检测和定位核酸和蛋白。46【注】BAP对高温和去污剂耐受性强，在去磷酸化反应结束后，若不能完全抑制其活性，则不能保证随后的连接反应有效地进行,。CIP具有明显的优点，在蛋白酶K及或在5mmol/L EDTA存在下加热（65 60min或75 1015min)可完全失活，去磷酸化的DNA可通过酚-氯仿抽提纯化，因此目前主要使用CIP。47 （四核酸酶（四核酸酶 BAL31核酸酶核酸酶主要活性为3外切核酸酶活性，可从 线状DNA两条链的3端去

24、除单核苷酸。用于 通过可控 方式去除双链DNA的末端核苷酸，缩短后的分子具有 多种用途，如产生缺失、对启动子或其他调控序列进 行定位等。 S1核酸酶核酸酶降解单链DNA或RNA，产生带5磷酸的单 核苷酸或寡核苷酸，用于分析DNA：RNA杂交体的 结构，打开双链cDNA合成中的发夹环，去除DNA片 段中突出的单链尾以产生平端。48 核糖核酸酶核糖核酸酶A（胰）（胰）内切核糖核酸酶，可特异地攻击 RNA 上嘧啶残基的3端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸 二酯键。用于从DNARNA或RNARNA杂合体中去 除未杂合的RNA区。 注意：要制备不含DNA酶的核糖核酸酶，在配置贮存 液时需加热到100，15

25、min49(五蛋白水解酶五蛋白水解酶蛋白酶蛋白酶K是枯草杆菌类的高活性丝氨酸蛋白酶，由静止培养的温和的霉菌菌种分泌产生。催化水解多肽键，对芳香类和去电荷的氨基酸多肽键的羧基端尤甚用途用途消化天然蛋白，能快速灭活细胞溶液中的DNA和RNA酶，便于高相对分子质量DNA和完整RNA的分离 备用溶液 贮存温度 反应浓度 反应缓冲液 温度20mg/ml水溶 20 50g/ml 0.01mol/L tris-Cl 3756液（50mol/L (pH7.8)tris-Cl (pH8.0) 0.005mol/LEDTA1.5mol/Ca (CH3COO)2 0.5%SDS50第三节第三节 多聚酶链式反应（多聚

26、酶链式反应（PCR多聚酶链式反应多聚酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR)是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。Mullis等人于1985年发明PCR.EXE51基本原理：基本原理：以分别位于待扩增DNA区段两侧的两段序列互不相同并分别与模板DNA两条链上的各一段互补的寡核苷酸为引物引物。反应分三步：(1)变性(denaturation)-通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；(2)退火(anneal

27、ling)-随之将反应混合液突然冷却至某一温度，反应体系中摩尔数大大过量的引物DNA可与其互补的模板在局部形成杂交链；(3)延伸(extension)-在DNA聚合酶、4种dNTP底物及Mg2+存在下，催化以引物为起始点的53的DNA链延伸反应。如此反复进行变性、退火和DNA合成的循环，新合成的DNA链又成为下一轮循环的模板，这一周而复始的过程每完成一个循环，基本上目的DNA就增加1倍，使介于两个引物间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2106-7拷贝52防止防止PCR污染的重要性及措施污染的重要性及措施PCR是一项敏感性极高的技术，即使104细胞中含有一个拷贝的待检核酸序列，也可被检

28、测出来。PCR的特性决定了进入反应的唯一DNA必须是实验者所加的模板，所以PCR应该在一个没有DNA的环境中进行。随着PCR的广泛使用，最严重的问题是靶序列的污染，这在PCR之前就可能发生。如果不认识控制模板和PCR产物引起的污染的重要性，不采取相应的措施，PCR对你的研究只会有害，不会有益。53防止污染的措施：防止污染的措施：1）PCR实验室的建立：从事对污染很敏感的PCR分析，如 测定样品中靶序列的数量及以靶序列的有无作为诊断标 志，必须建立严格的工作区域将PCR的样品制备、PCR 反应区以及PCR产物分析区完全隔离。对把PCR用作对 污染不敏感的分子生物学工具，如基因的克隆及探针的 制备

29、，也应加以注意，分开区域操作。2）样品制备应按无菌操作的原则进行，避免样品间的污染。3）试剂的配制、分装和保存的有关操作都应在无PCR产物 的环境中进行，小量分装试剂，配制总反应混合液。4）设立空白对照，即除了不加入模板DNA外，实验的全 过程都处于完全同等的条件。 54PCR中遗留污染的酶法控制中遗留污染的酶法控制污染的DNA可能有三个来源：来自其它测试样品的DNA、来自实验材料如重组克隆的DNA、或者来自同一靶序列前一次PCR的扩增产物。最后一种污染，通常称作“遗留”（carryover)污染，是由于操作PCR产物时的气溶胶所致，是最为麻烦的一种。诊断PCR中最广泛应用的控制污染的方法就是

30、UNG和dUTP系统。在PCR中常规使用dUTP，置换dTTP，使产物中含有尿嘧啶，对尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG，也称尿嘧啶N-糖基化产物或UNG）敏感,可以有效地抑制PCR产物的重扩增。55CTGACTAGTGACTGATCA在dNTP存在下PCR扩增N个循环CUGACUAGUGACUGAUCA2NPCR试剂不小心被dU-DNA所污染向下一个PCR反应混合物中加入UDG 于37温育10min消化dU-DNAC GAC AGGAC GA CA95,10min，灭活UDG消化DNA片段CAGACGACAGCGA污染的DNA没有被扩增UDG法防止PCR中遗留污染简图56PCR反应的成分和作用反应

31、的成分和作用1 PCR反应的缓冲液反应的缓冲液Mg2+浓度：是影响反应特异性和扩增片段产率的重要因素， 一般为1.52.0mmol/L，范围从0.55.0 mmol/L。10mmol/L TrisCl(室温下pH=8.38.8)：主要靠其调节pH 使 Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。 标准PCR缓冲液内含有50mmol/L KCl，它对于扩增500bp 长度的DNA片断是有益的。DMSO（二甲基亚砜：可减少模板的二级结构，提高PCR 反应的特异性，在扩增高GC含量的DNA模板时可以加入 适量（10%)。572 底物底物(dNTPs)浓度浓度标准PCR反应体系中包含4种等摩尔浓度的dN

32、TPs，dNTPs浓度应在20200mol/L。dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度下降，但可提高实验的精确型。4种dNTP在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。dNTP溶液具有较强的酸性，使用时应以NaOH将pH值调至7.07.5（公司销售的为pH8.0), 分装小管，与20存放，可防止原液在冷冻与融化时损坏dNTP分子结构。583 引物引物引物浓度一般为0.10.5mol/L（即6101231013个分子），浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，还可增加引物之间形成二聚体的机率，均会使目的DNA合成

33、产率下降。在整个PCR扩增体系中，引物的设计占有十分重要的地位引物的设计占有十分重要的地位。PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是多聚酶对引物的有效延伸。引物的精心设计其目的在于获得高产率的目的扩增产物，抑制非特异序列的扩增以及扩增DNA产物的后续操作。59引物设计一般遵循下列原则：引物设计一般遵循下列原则：1引物长度以1825bp为宜，上下游引物的长度差别3bp。2引物碱基尽可能随机分布，GC含量宜在4060%左右。3引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。4引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列， 这种序列可形成发夹结构，会阻

34、止寡核苷酸核靶DNA的 复性。5）两个引物之间尤其在3末端不应有互补链存在，引物间的 微弱互补，都会导致引物间形成杂交，引发引物二聚体 的形成和扩增。6）计算出来的两个引物的解链温度（Tm）值相差5。607引物3末端的性质非常关键，原则上碱基一定要与模板 DNA配对。8引物5末端碱基并没有严格的限制，只要与模板DNA 结合的引物长度足够，其5末端碱基可以不与模板DNA 匹配而呈游离状态。一般在引物5末端最多可以游离数 10个碱基并不影响PCR反应的进行。引物设计时可以 在5末端加上限制性内切酶位点或其它短的序列，由于 位于DNA分子的5末端的限制性内切酶位点的切割效率 比较低，所以引物应超出限

35、制性内切酶识别位点至少3个 碱基。614 耐热耐热DNA聚合酶聚合酶在2550l反应体系中，一般所需Taq DNA聚合酶的用量为0.52.5U，根据扩增片段的长短及其复杂程度（GC含量不同而有所区别。Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性, 测试结果为：92.5、95、 97.5下， Taq DNA聚合酶的生物半衰期分别为130分钟、40分钟和56分钟。在PCR反应中，变性温度一般为9430秒1分钟，以循环30次计算， Taq DNA聚合酶可保证PCR反应的需要。62Taq DNA聚合酶缺乏35外切酶活性，因此，在PCR反应中如果发生某些单核苷酸的错配，这种酶是没有校正功能的。所以需要对PCR

36、产物进行DNA序列分析。不同来源的Taq DNA聚合酶在扩增效率，扩增片段的长度和保真度上都有差异。Taq DNA聚合酶是常规扩增小片段DNA时的首选酶类。为了得到某个基因高保真度的拷贝，就应选用具有校正功能的酶；如果要对扩增片段进行克隆，则需选用产生平端的酶。63Taq DNA聚合酶有类似于末端转移酶的非模板依赖的延伸性，并对A有优先选择性，使得PCR产物的两单链的3端往往带有一个非模板依赖的碱基A，给PCR产物的直接与平端载体相连接造成困难，效率很低。解决方法：（1先利用T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I大片段对PCR产物进行处理，然后再与平端载体连接，可以明显提高克隆的效率。（2

37、在合成PCR的引物上直接引入限制性酶切点，扩增完成后再用限制酶切从而获得粘性末端而进行连接。（3目前已有商品化提供的利用ddT或dT加尾的载体专供PCR产物直接进行克隆。645NNNAAGCTTHindIII序列CCATGGNNN5 KpnI序列PCR扩增5NNNAAGCTT3NNNTTCGAACCATGGNNN5GGTACCNNN3用HindIII和KpnI消化5AGCTT 3AGGTAC3C5 PCR产物加入限制性酶切位点655 模板模板PCR反应中对DNA模板的要求并不严格。首先对纯度要求不是十分严格，样品间没有交叉污染很重要。其次，模板用量很低，理论上102104拷贝的模板足可满足各种

38、要求的PCR反应。*1g人单拷贝基因组DNA的靶细胞数3105，100 l PCR 反应体系中，加0.1 g基因组DNA。 10 g酵母DNA靶细胞数3105，摸板量10ng。 1 g大肠杆菌DNA靶细胞数3105, 细菌和质粒的摸板量依次 是1ng和1pg。66模板的来源可以是血液（新鲜抗凝血、陈旧血块等、新鲜组织块和石蜡包埋组织、各种脱落细胞、毛发、尿样及粪便，还有从新鲜组织细胞中制备RNA模板。根据不同样品，采用不同的方法。抑制剂PCR反应体系中任何成分的过量存在都有可能成为抑制PCR反应的因素。常见的抑制剂有蛋白酶K，苯酚和EDTA。其他的一些物质，例如离子型去垢剂，肝素，血红蛋白和上

39、样凝胶中的染料如溴酚蓝等。676 PCR反应条件的选择反应条件的选择变性变性：9095条件下，即使再复杂的DNA分子，如人基 因组DNA也可变性成为单链，一般情况下先进行94 3分钟，然后进入循环，每次变性为9445秒。退火退火：复性过程采用的温度（Ta)至关重要，通常在比理论 计算的引物和模板形成的杂合分子的溶解温度低35C 的条件下进行。温度的选择可以根据引物的长度和其 GC含量确定。长度在1525bp之间，可通过公式 计 算得到： Tm/C=4 (G+C)+2 (A+T) 长度14bp, 长达60-70bp 可用以下公式： Tm/ C =81.5-16.6 lgK+0.41(%G+C )

40、-(675/n) 在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少 引物与模板之间的非特异结合，提高PCR反应的特异 性。退火时间设置为30秒。68延伸延伸：温度建议选择在7278之间，此时Taq DNA聚合 酶具有最高活性。时间根据扩增片段的长度而定，在 最适反应温度下, Taq DNA聚合酶的聚合速率约为 2000bp/min, 一般 1kb以内的片段，用1分钟即可。循环次数循环次数：主要取决于反应体系中起始的模板拷贝数以及 引物延伸和扩增的效率。用Taq DNA聚合酶（效率约为 0.7)在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30 个循环后既达到理想情况，以含有单拷贝的靶序列的哺

41、乳动物DNA为模板，至少需要进行25个循环才能得到 足够量的扩增产物。最后一次循环的延伸时间一般要保 持5分钟。69平台效应平台效应：是指PCR循环的后期，合成产物到达0.31pmol 水平，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变 成平坦曲线。到达平台期所需PCR循环次数取决于样 品中模板的拷贝数、底物或引物等消耗、DNA聚合酶 的种类和活性、以及非特异性产物的竞争等因素。平 台期在PCR反应中是不可避免的，但一般在此之前， 合成的目的基因片段的数量足可满足实验的需要。70热启动：热启动：是一种在PCR反应中优化目标扩增产物的方法，同时也抑制非特异扩增。这是通过控制PCR反应的必须组分如DN

42、A聚合酶或镁离子，直到反应混合液被加热到可以阻止非特异引导和引物聚合的温度启动PCR来实现的。热启动主要用于下列情况：非特异扩增较为严重；反应中的模板DNA少于104个拷贝数；模板DNA复杂度非常高；多重PCR。71介绍几种介绍几种PCRPCR反转录反转录PCR(reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)RTPCR是从RNA扩增cDNA拷贝的方法，对于从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库是极为灵敏与通用的方法。RT-PCR还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，测定基因表达强度，尤其是在获得的mRNA数量有限和目的基因表达水平很低时可用RT-PCR

43、方法来分析。72 RNA的分离 AAAAAAA（A）n AAAAAAA（A）n AAAAAAAA（A )n cDNA的合成基因特异性引导 随机六核苷酸引物引导 oligo(dT)引导 AAAA（A）n AAAA（A）n AAAA（A）n GSP TTTTT N6 N6 AAAA（A）n AAAA（A）n AAAA（A）n TTTTT PCR循环 1 PCR循环 1 PCR循环 1 AAAA（A）n AAAA（A）n AAAA（A）n TTTTT 正义引物 正义引物 正义引物 循环 2 循环 2 循环 2 反义引物 正义引物 持续热循环73锚定锚定PCR(anchored PCR)锚定PCR可以

44、帮助克服序列未知或未全知带来的障碍，其基本原理是依靠添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，同时使用与同聚物尾碱基互补配对的人工合成的锚定引物，在与基因特异配对的引物参与下，可以扩增此带同聚物尾的cDNA序列。现称为5RACE技术（RapidAmplification of cDNA Ends, RACE)，用于捕获缺失部分的cDNA，再用PCR方法扩增全长分子。该项技术包括三个连续的酶促反应（反转录、同聚物加尾和PCR扩增），有一定的难度。7475不对称不对称PCR （asymmetric PCR)在扩增循环中引入不同引物浓度，而得到单链DNA产物。一般采用50100：1比例的引物浓度，

45、在最初1015个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度引物被耗尽后，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。 引物 A (2550pmol) 5 引物 B（0.5pmol) PCR 双链DNA 0.5pmol 单链DNA 510pmol .不对称PCR示意图76反向反向PCR (inverse PCR)反向PCR可以对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，连接形成环状DNA分子，此时选择合适方向的与已知序列两末端互补的引物，经PCR后，可以得到未知序列的DNA片段，用此方法建立基因组步移文库，在分子生物学研究上

46、是非常有意义的。77 限制酶切点 (X) 限制酶切点 (X) 已知序列 未知序列 限制酶X酶切 连接 PCR 未知序列 引物 2引物 1反向PCR示意图78多重多重PCR (multiplex PCR)PCR技术的一个重要应用领域是检测特定序列的存在或缺失。在许多情况下，与疾病相关的基因十分庞大，如DMD有2000多kb长。这些基因上常有多处发生缺失或突变，而且这些改变发生在相邻数十个至数百个kb的距离，这就超出了PCR技术所能扩增的有效长度。采用多重PCR技术，即在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。如果基因的某一区段缺失，则相应的电泳图谱上这一区带就会消失。目前报道的多重PCR，最多可同时扩增12条区带。79I1 II1 III1 N1I2 II2 III2 N2 1 2 3 4 M1.正常对照；2. 3. 4. 不同病人样本；M. DNA分子量标准多重PCR示意图80