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1、生物技术药物的质控体系质量标准研究内容检定方法、质控标准n 理化性质：外观（形状、颜色、气味）、pHn 均一性：纯度、浓度n 鉴别n 结构确证n 效价：生物学活性、免疫学活性n 残余杂质：产品、工艺、环境相关的杂质n 起草、制定制造与检定规程n 研究建立国家标准品或参考品重组蛋白质药物质量标准研究n 效价：生物学活性与比活性n 蛋白质纯度n 蛋白质含量n 理化性质鉴定（部分非常规）n 残余杂质n 安全性及其它项目一 生物学活性及比活性测定(一) 检测意义 获取准确的效价信息，保证产品有效效价：有效性指标，反映药品效力生物学活性才能真实反映生物技术药效价原因：生物制品分子大、结构复杂、不稳定，使
2、得重量与效价不一致生物制品技术药：单位（U、AU、IU）（二） 生物学活性测定方法分类1、动物基础的活性测定 离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉 体内测定法： EPO的小鼠网织红细胞2、细胞基础的活性测定n 促细胞生长法：大多数细胞因子类n 抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂n 间接保护细胞法：IFN保护WISH3、酶学基础的活性测定：重组酶类4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定： 抗原决定簇与活性中心常不一致（三）生物学活性测定方法选择1、细胞培养法离体器官法体内法2、细胞染色标记方法： MTT 3H-Thymidine 流式细胞仪 （测细胞周期、凋亡）3、定量法半定量法定性法4、
3、生物学活性不一定与临床药效类型一致工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。 如rh-GH用HPLC（四）生物学活性测定（见药典附录C）1、样品：原液、成品2、方法：如上述（好好研究？）3、标准： 不同生物活性测定方法的规定标准 测定方法 规定标准动物基础的活性测定 70%-130%标示量细胞基础的活性测定 80%-120%标示量酶学基础的活性测定 85%-115%标示量结合反应的活性测定 85%-115%标示量（五）蛋白质药物的比活性（见分生实验册77页）？1、样品：原液2、定义与计算： 比活性：单位重量蛋白的活性单位数（IU/mg)3、标准：不小于。IU/mg4、意义：1）真实反映有活性的蛋
4、白质所占的比例 厂家间、表达系统间、批间比较2）便于配制成品二 蛋白质纯度检查n 样品：原液n 方法：必须采用二种方法测定 非还原SDS-PAGE法 HPLC法n 标准：纯度均须达到95%或98%以上非还原SDS-PAGE法测定纯度（见药典附录C）n SDS-PAGE：据分子大小分离n 样品处理：样品不加-ME或DTT 二硫键未打开，反映单体、二聚体或多聚体情况n 染色方法与上样量 银染: 5ug（检测限为1-10ng） 考马斯亮蓝R-250：10ug（检测限为0.1ug）n 定量方法：凝胶扫描n 标准：无明显杂带，纯度95%或98%HPLC法测纯度？（见药典附录B）n 分析柱：反相柱、离子柱
5、、分子筛 应尽量采用反相柱或离子柱 应注明采用的分析柱性质n 上样量：5ugn 标准：出峰时间正确 纯度：95%或98%三、蛋白质含量测定(见药典附录D)n 样品：原液、成品n 方法：*Folin-酚试剂法（Lowry法）：（见分生实验册67-73页） 简便、灵敏、优先采用，灵敏度：5-100ug/ml *染色法（Bradford法）： 考马斯亮蓝G-250，简便灵敏， 25-200ug/mlBCA(二喹啉甲酸)法：操作简单，比Lowry法快4倍且更加方便，准确灵敏：20200 ug/ml，微量BCA的测定范围在0.510 ug/ml。经济适用 ，抗试剂干扰能力比较强。紫外分光广度法： 用于原
6、液比活性计算和成品规格控制四、蛋白质药物理化性质鉴定（一）特异性鉴别试验1、样品：原液和成品2、方法：免疫印迹法 Western Blot、 Dot Blot3、标准：应该阳性（二）相对分子量测定1、样品：原液2、方法：还原型SDS-PAGE（见分生实验册51页、见药典附录C）、质谱法3、标准： 1）理论值10%范围 2）批与批间一致（三）等电点测定（见药典附录D）1、样品：原液2、方法： IEF：常规等电聚胶电泳（见分生实验册55-57页） CE：毛细管电泳3、标准： 1）有明显主带 2）理论值0.5pH范围 3）批与批间一致（四）紫外吸收光谱分析（见药典附录A）1、样品：原液2、方法：紫外
7、扫描3、标准： 1）最大吸收波长与特征波长一致 2）批与批间一致（五）肽图分析（非常规）（见药典附录E）1、样品：原液2、方法： 溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/ SDS-PAGE/CE/质谱法3、标准： 1）有特征性图谱 2）批与批间一致（六）氨基酸组成分析（非常规）1、样品：原液2、方法： HCl/NaOH水解（仅用于Trp测定） +氨基酸自动分析仪3、标准： 1）与理论值一致 2）批与批间一致（七）氨基酸序列分析（非常规）1、样品：原液2、方法： N末端： 15个残基， Edman化学降解法，蛋白质全自动测序仪 C末端： 1-3个残基 硫氰酸酯/羧肽酶降解法，RP-HPLC3、标准： 1
8、）与理论值一致 2）批与批间一致（八）其它：二硫键、糖基化（非常规）五、残余杂质检测（一）宿主相关杂质 宿主细胞蛋白含量：（见药典附录C）1、样品：原液、成品2、方法： 双抗体夹心ELISA：用HAS作保护 宿主蛋白标准品：中检所提供3、标准： 1）大肠杆菌0.1% 2）CHO 0.05%宿主细胞DNA含量（见药典附录B）1、样品：原液、成品2、方法： DNA点印迹杂交法，地高辛标记 DNA标准品：厂家提供3、标准： DNA含量10ng/剂量细菌内毒素含量（见药典附录E凝胶限量实验）1、样品：原液、成品2、方法： 鲎试剂分析法鲎试剂标准品：中检所提供3、标准： 内毒素含量1/剂量（二）工艺相关
9、杂质（见药典附录A） 如残余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清（三）产品相关杂质 如多聚体、不同的PEG修饰产物六、安全性及其它检测项目（一）无菌试验 平皿法，需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体（二）热原试验 鲎试剂法或家兔法（三）异常毒性试验 小鼠（1ml)或豚鼠（5ml），腹腔注射（四）水分、装量、pH值原液质量标准n 生物学活性、比活性（见药典附录C）n 蛋白质含量(见药典附录D)n 纯度：95%，非还原SDS-PAGE法（见药典附录C）、HPLC法（见药典附录B）n 分子量：还原型SDS-PAGE法（见药典附录C）、质谱法n 外源性DNA残留量： 10ng/剂量（见药典附录B）n 宿主蛋白残留量: 0.1%，0.05%（见药典附录C）n 残余抗生素：不得检出（见药典附录A）n 细菌内毒素：10EU/剂量（见药典附录E凝胶限量实验）n 结构确证：等电点（见药典附录D）、紫外吸收光谱扫描（见药典附录A）、N末端15个氨基酸顺序、肽图（见药典附录E）、（氨基酸组成、）成品质量标准n 鉴别试验：免疫印迹法/斑点法，阳性n 物理检查：外观、可见异物、装量n 化学检定：水分、pH值n 生物学活性：标示量的%范围n 无菌检查：不得检出n 内毒素检查： 10EU/剂量n 异常毒性检查：符合规定
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