AD特异性分子探针[18F]AV-45和[18F]-THK523的实验研究及联合诊断价值

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1、AD特异性分子探针18FAV-45和18F-THK523的实验研究及联合诊断价值课题研究内容及意义简介-淀粉样蛋白(-amyloid protein，A蛋白)和tau蛋白显像能直观灵、特异、敏地分别反应老年斑(Senile Plaque，SP)和神经纤维缠结（(Neurofibrillary tangles, NFTs）的变化情况。本项目研制性能优良的A蛋白显像剂18FAV-45和tau蛋白显像剂18F-THK523，进行合成化学、同位素标记化学、质量控制等研究，并进一步进行临床前的系列药理学、毒理学等研究，同时探讨其作为A蛋白和tau蛋白显像剂的临床价值和应用前景，设计了一种基于适合国人阿尔

2、茨海默病(Alzheimers disease，AD)的PET脑显像定量分析方法，提高AD的早期诊断，特别是轻度认知功能障碍（Mild Cognitive Impairment，MCI）患者的检出率。本项目为临床上以SP和NFTs为主要的病变如AD的早期诊断和疗效监测提供合适的正电子显像药物。报告正文（一）立项依据与研究内容： 1、项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）神经核医学是当前核医学领域的前沿与热点。应用放射性示踪剂进行中枢神经系统的显像研究

3、，可以阐明神经系统疾病的发生、发展机理，选择、确立治疗方案，还可以为治疗药物的研制提供指导。目前对AD的诊断主要根据临床症状并排除其他疾病，由于症状的非特异性和程度，使诊断缺乏准确性，最主要还有不能早期诊断1。AD是近十年来神经核医学的热点研究方向之一。AD的发生与脑神经元外内出现由淀粉样多肽 (amyloid-peptide, A)沉积组成的老年班（senile plaques, SP）和神经元内异常磷酸化tau蛋白组成的神经纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）、神经元丢失和轴突退行性改变等有关，SP和NFTs是AD的早期特征性病理改变。应用放射性示踪剂对A

4、D相关的脑病理改变及神经递质进行显像研究在国际上正迅速发展。这类显像主要包括A蛋白显像、tau蛋白显像和神经递质显像三个重要方向。针对AD特征性病理改变的A蛋白显像与tau蛋白显像联合显像可以综合评价AD病情变化，准确、全面早期诊断AD2。AD影响约5%的65岁以上人群，85岁以上人群其发病率超过50%，患病人数20年后将会翻一倍，全球痴呆患者人数有明显递增趋势，以发展中国家增长速度最快，2010年全球用于痴呆的治疗费用达6040亿，国际阿尔茨海默病研究中心预测到2030年该开支会增加85%3。鉴于我国老龄化人口在未来大幅增长，2050年60岁以上人口数讲翻一番，目前我国AD患病人数已超过60

5、0万人，若无有效地诊治手段，AD将会给社会、家庭带来沉重的精神和经济负担4。目前AD的早期诊断是AD诊治的瓶颈，针对潜在的AD发病机制，寻找靶向诊断方法及对新的治疗方法做出准确评价是目前AD研究的突破口和焦点。A蛋白作为SP和tau蛋白作为NFTs的主要成分，在AD发病机制中具有核心作用（如图1）。AD早期临床症状、心理学、脑电图、CT、MRI没有特异性，正电子发射计算机断层摄影(positron emission tomography，PET)通过放射性标记的代谢物或药物，可以从分子水平无创、定量地观察人体内的代谢变化，能早期做出特异性诊断。AV-45是A蛋白、THK523是tau蛋白的特异

6、性分子探针，对于AD的珍断和鉴别诊断有很高的临床价值。一些有潜能的AD治疗药物在临床试验阶段失败，让人们对A斑块作为AD发病主要机制假设的重新考虑，同时有必要寻找更有效的标记物。合成的靶向A蛋白的18F标记的分子显像探针(E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-18F-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶-3-基)乙烯基)-N-甲基苯胺(18F-AV-45)(E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-18F-fluoroethoxy)ethoxy)ethoxy)pyridin-3-yl)vinyl)-N-methyl benzenamine,18F-AV-45)特异性与A蛋白结合。AD的早期诊断目前主

7、要集中在A，针对tau蛋白显像剂的非创伤性定量分析还没有研究，18F-THK523作为一种目前唯一报道的tau蛋白显像剂，靶向tau蛋白的18F标记的分子显像探针18F-THK523与tau蛋白特异性结合。因此，PET在体显像，可使AD患者脑中的SP和NFTs特异性标记，联合显像，提高AD临床诊断和疗效监测研究。A蛋白由淀粉样前体蛋白（APP）的蛋白裂解而形成的以39-43个氨基酸残基为特征的肽，A沉积是导致AD疾病的早期主要原因5-12。神经生物学研究表明，在AD的病变过程中A蛋白的变化比胆碱能神经递质的变化更加敏感和特异。A蛋白显像更能灵敏地反应AD的病情变化情况。同时，Tau蛋白病理性磷

8、酸化是AD的特征性早期病理改变，产生神经毒性13, 14，检测tau蛋白可以反映神经元损伤15。临床上研究发现AD患者葡萄糖代谢减低，但老年人群几乎有糖代谢减低，Liu Fei16等认为葡萄糖代谢障碍是NFTs的病因之一，因为糖代谢障碍促进tau蛋白异常磷酸化。AD早期特征性症状就是记忆进行性减低，这与脑海马（特别是CA3）与皮层神经回路的异常相有关，研究表明tau蛋白异常磷酸化在发病中起主要作用，为探索NFTs前期的病理改变并对AD的研究提供一种定量分析技术17。A可诱导tau磷酸化，Tau介导A诱导的神经退行性变18，同时，A也促进微管解体16。通过脑组织尸解、三联基因AD鼠和tau基因突

9、变鼠模型研究表明tau蛋白的异常磷酸化可由神经元内A低聚物沉积、慢性氧化应激、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）减少、A介导的星形细胞激活、A介导的凋亡激活、tau蛋白基因突变等因素介导，异常磷酸化的tau蛋白N末端与A低聚物作用于线粒体，引起线粒体功能障碍，使活性氧族（reactive oxygen species, ROS）增加、细胞色素C氧化酶减少和ATP生成减少，进而使轴突转运异常、突触功能受限制、神经元损伤19，正常神经元中，tau蛋白紧密结合到微管，保证轴突正常转运细胞器，在AD患者中，异常磷酸化的tau蛋白使微管稳定性丧失

10、、线粒体功能障碍，因而使轴突的正常转运出现障碍19。到目前为止，国内外已研制了一系列的A蛋白显像剂。根据所用放射性核素的不同，主要分为以下几类：123I 标记的化合物，如：毒蕈碱型AchR(mAchR)的高亲和力配体123I-IQNB20、烟碱型AchR(nAchR)配体123I5-I-A-8538021、中枢型苯二氮卓受体(Benzodiazepine Receptor ,BZR)配体123I-IMZ22、5-HT2A受体拮抗剂显像剂123I-5-I-R9115023 、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体配体123I-MK-80124等等；125I标记的化合物，如A蛋白显像剂125I-

11、IMPY25;11C 标记的化合物，如：mAchR显像剂11C-NMPB26、nAchR显像剂11C-nicotine27、中枢型BZR显像剂11C-FMZ28、周围型BZR显像剂11C-（R）-PK1119529、多巴胺D1受体拮抗剂显像剂11C-NNC75630、 D2受体拮抗剂显像剂11C-raclopride31、多巴胺再摄取位点显像剂11C-beta-CFT32、组胺系统H1受体显像剂11C-doxepin33，A蛋白显像剂4-schiff-o11CH334、11 C-6-OH-BTA-1即11C-PIB35、11CSB-1336、11CBF-22737、11C(R)-PK11195

12、29等等；18F 标记的化合物，如5-HT2A拮抗剂18F-altanserin38，A蛋白显像剂18F-FDDNP39、18FBAY94-917240、18FGE-067(18F-3-F-PIB)41、18FAV-13842, 43等等；3H标记的化合物，如nAchR配体3H-nicotine44、3H-epibatidine45、A蛋白显像剂3HAZD218446。15O标记的化合物研究较少，如中枢型BZR显像剂15O-H2O28。其中123I 标记的显像剂在欧美国家已比较成熟，许多已进入临床研究。国内因123I 不能供应限制了发展。正电子药物有其特殊优势，在难以定量诊断的神经认知疾病中有

13、潜在价值47。11C-PIB在国外已进入临床使用，国内本中心率先研制成功并已运用于临床48，是目前诊断AD的有效显像剂。各类神经递质相关显像剂的特异性有待于进一步改进，3H标记显像剂半衰期太长、15O标记显像剂半衰期太短、11C 标记的A蛋白显像剂半衰期太短，临床应用受限制。18F 具有合适的半衰期（110分钟），便于药物的制备，以及适中的能量（510MeV），是目前最理想的正电子显像核素，18F 标记的A蛋白显像剂发展很快。18FAV类显像剂与A蛋白亲和力很高，18FAV-45研究较多，Wong等49于2010年第一次将18FAV-45应用于人体试验，国内尚无研究。相比较各类A显像剂而言，1

14、8FAV-45是一种良好的A蛋白显像剂12。在本中心参与的上海市科委重大科研项目项目“老年性痴呆的早期诊断”、“核素基药物和诊断试剂的应用研究”和上海市经贸委项目“AD病早期诊断的正电子放射性药物研究”等科研项目中已证实A类显像剂有用于AD早期诊断的潜能。18FAV-45是近年来研制的一种新的有潜能的A蛋白显像剂50。在所有已有报导的A蛋白显像剂中，18FAV类性能最优。与11C-PIB相比，其显著优点有：(1) 18F半衰期为110min,使显像稳定，有利于进一步研究，生产一批药物可以多次使用，可以降低一半的成本；(2)与A蛋白的特异性更好，因此更有利于评价A蛋白的细微变化(如AD严重程度的

15、评价)12。因此研制18FAV类显像剂很有必要。国际上关于tau蛋白显像剂的研究仅Melbourne大学一家，该研究小组进行了合成、动物实验研究，但还未用于人显像。国内尚未见其它单位报道。18F-THK523作为目前唯一的tau蛋白显像剂，体内研究示其与重组体tau蛋白的多位点具有很高的亲和力，人脑海马切片自显影和组织荧光示THK523特异性与有免疫反应的病理tau蛋白出现病理性结合，Micro-PET示，与野生同窝鼠、Ab前体蛋白(b-amyloid precursor protein，APP)/早老素-1（presenilin-1，PS1）转基因鼠相比，18F-THK523在tau蛋白转基

16、因鼠脑中有相对高的保留时间（48%；P0.007）。体内、外研究示THK523对病理性tau蛋白有高亲和性和选择性，可对tau进行无创性定量分析，有助于AD早期诊断51。（A显像剂的不足）国际上、国内关于联合运用A显像剂和tau蛋白显像剂对AD早期诊断尚未见报道。开展此项研究，可以为A蛋白显像和tau蛋白显像提供目前最为优良的显像剂，将有助于进一步推动国内神经核医学关于AD的研究。紧跟该领域的国际前沿，在国内可达领先水平。该显像剂在临床推广后，可以为AD的疾病提供一种优良的显像剂，为AD的诊断和治疗研究提供直观的显像图。A蛋白和tau蛋白主要存在于SP和NFTs中，是脑组织固有蛋白，AD患者明

17、显增高，建立基于18FAV-45、18F-THK523的健康脑和AD标准脑A蛋白、tau蛋白数据库模板，该模板旨在利用PET显像这一强大的分子影像学手段，采用数字化，规范化及标准化等信息技术的形式为AD提供全新的诊断方法及标准。具体包括以下几个方面：选择健康对照(HC)和AD人群样本；进行18FAV-45脑A蛋白和18F-THK523脑tau蛋白显像；随时间观察靶部位感兴趣区（ROI）与非靶部位ROI的SUV比值变化。观察并研究HC组和AD组不同年龄组和性别间脑A蛋白、tau蛋白的分布规律，建立不同性别、年龄组段的18FAV-45-PET、18F-THK523- PET功能标准脑数据库。应用信

18、息模板可对疾病的早期诊断、分型、分期及治疗监测等进行分析。此模板以提高脑部疾病诊断准确性为目的，在医学图像数字化及网络化的基础上，可实现脑部功能性异常疾病诊断的一致性，尽量减少甚至消除影像学医师诊断时的主观性以及由于经验不足而造成误诊的可能性，同时使得不同医疗机构在交流、远程会诊时有了统一的参考及诊断标准。PET 显像是当今我国核医学显像发展非常迅速的领域，国内各大医院纷纷引进，至2009 年5月底，全国已有约118台PET 投入使用。而PET 显像药物是目前影响我国PET 研究领域的瓶颈，该项目研制的PET 显像药物可以扩大PET 的应用范围，充分发挥进口昂贵仪器的作用。开展此项研究可以使我

19、国在该领域达到国际先进水平。图1 AD的病理改变及药物作用靶点参考文献 1 van der Zee J, Sleegers K, Van Broeckhoven C. Invited article: the Alzheimer disease-frontotemporal lobar degeneration spectrumJ. Neurology,2008,71(15):1191-1197. 2 Snowden J S, Thompson J C, Stopford C L, et al. The clinical diagnosis of early-onset dementias:

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49、 J. Brain,2011,134(4):1089-1100.2课题研究内容、拟解决的关键问题、具体研究目标及其在项目中所起的作用2.1 研究内容：本项目包括如下五个角度的研究内容： 脑18FAV-45 PET显像剂的制备及标记条件优化、脑18FAV-45 PET显像剂的生物学研究（电荷及脂水分配系数测定）； 脑18FAV-45、18F-THK523 PET显像剂相关研究：体外稳定性、体内分布及初步药代动力学分析、血浆蛋白结合率测定、放射自显影分析、放射性配体受体结合分析、动物体内毒性研究； AD疾病动物模型的建立及行为学和分子影像评价； 1998-2011年中国老年人群痴呆患病率系统分析；

50、 建立18FAV-45、18F-THK523的HC和AD标准脑A数据库模板。2.2关键技术： 化学合成及纯化技术 同位素标记方案 AD动物模型的建立 回顾性分析中国老年人群患病情况 国人Brodmann区参数获得及18FAV-45-PET、18F-THK523-PET功能标准脑建 应用18FAV-45-PET、18F-THK523-PET功能标准脑进行疾病诊断及治疗随访2.3拟解决的关键问题： 选择具有二次开发潜能的前体药物AV-45、18F-THK523前体2-(4-aminophenyl)-6-(2-tosyloxyethoxy)quinoline(BF241) 探究脑18FAV-45 P

51、ET、18F-THK523 PET显像剂的标记条件 进一步研究脑18FAV-45 PET、18F-THK523 PET显像剂的脂溶性大小、带电情况，验证其作为脑受体显像剂的条件 研究脑18FAV-45 PET、18F-THK523 PET显像剂的稳定性，其在正常动物的体内分布情况并结合放射自显影研究验证 研究18FAV-45 PET、18F-THK523 PET显像剂的毒性，为进一步研究提供参考 建立AD动物模型并用分子影像技术进行评价 临床上AD疾病的调查研究 使AD的诊断定量化、规范化、准确化2.4 研究目标： 制备出放化纯大于95%的18FAV-45和18F-THK523 PET 探讨并

52、证实其用于AD的应用价值 分析目前国人的AD情况 18FAV-45、18F-THK523 PET标准脑图谱的建立，形成体系 发表论文5 篇以上，申报国家专利一项以上3本课题的研究特色与创新之处 18FAV-45、18F-THK523 PET分别是目前最有潜能的A蛋白和tau蛋白显像剂。本项目为PET 技术用于AD的研究提供了又一种新的正电子显像药物 18FAV-45 Melbourne大学的标记方案产率低、耗时、操作繁琐，本项目中尝试采用自动化的模块亲核取代反应直接制备18FAV-45，因此本项研究为18FAV-45的制备解决优于国际上的方案，可申报国家专利1-2 项 18F-THK523 是

53、目前唯一的tau蛋白显像剂，其在AD的标志性诊断具有特殊价值 脑18FAV-45 PET、18F-THK523 PET显像剂联合对AD的诊断国内外尚无报道，采用的研究手段可为对AD的进一步研究提供参考 本研究在解决多个关键技术和应用标准的基础上建立以18FAV-45 PET、18F-THK523 PET为主的国人正常成人和AD功能标准脑信息数据库，并进一步以此为基础建立全新的脑分子影像学诊断标准，使AD诊断定量化。3拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）3.1 研究方法 合成高纯度的前体AV-45和BF241，研制性能优良的A蛋白显像剂18FAV-4

54、5和tau蛋白显像剂18F-THK523，同位素标记优化、质量控制、生物学特性及相关研究，分析国人AD流行病学情况，设计了一种基于适合国人AD的PET脑显像定量分析方法。3.2 技术路线3.3 实验手段第一部分：脑18FAV-45 PET显像剂的制备及生物学研究1、标记方法：1合成目标前体：并经经过质谱及核磁氢谱证实化学结构2制备脑18FAV-45 PET显像剂并进行质量控制应用回旋加速器，生产所需核素，对前体进行标记：并注意控制好反应温度、无水的条件及反应溶剂的选择。得到标记物后，鉴定通过液相质谱联用仪，核磁鉴定。PET显像剂较SPECT显像剂的优势还具有能够纯化，因此纯化柱子的选择也很关键

55、。3质量控制（1） 物理学鉴定：观察物理性状，测定放射性活度、放射性浓度、比活度、半衰期和放射性核纯度。（2） 化学鉴定：测定化学性质(主要为pH值和稳定性)、原材料的质量控制、化学纯度和放射化学纯度（3） 生物学鉴定：无菌检查、细菌内毒素检查及异常毒性（4） 其他：1) 脑18FAV-45 PET显像剂标记率的检测方法：采用薄层色谱（thin layer chromatography ，TLC）和高效液相色谱（high performance liquid chromatography ，HPLC）测定。2) 放化合成时间，衰减校正后的放化产率，脂溶性分数，稳定性，验证主要质量控制指标是否达

56、到正电子放射性药物质量要求。4、脑18FAV-45 PET显像剂的生物学特性研究4.1电荷测定方法：通过电泳实验测定配合物电性，溶液介质选用V（生理盐水）:（乙醇）:（磷酸盐缓冲液，pH=7.4）= 1 : 1 : 1的缓冲液。将新华1号纸用毛细管点样后将电泳条的两端浸入缓冲液槽中，通电，电压调节在150V。待电泳条完全润湿后开始计时，通电3h后测量电泳条上的放射性分布，从而判断配合物电性。4.2 脑18FAV-45 PET显像剂的脂水分配系数测定方法：取0.2mL脑18FAV-45 PET显像剂，加1 mL水饱和的正辛醇，1 mL正辛醇饱和的水，涡旋振荡5min，静置5min分层，2000r

57、/min离心分离10min，分别取有机相和水相各0.1mL测计数，再取0.5mL水相加入另一放免管中，取0.5 mL正辛醇饱和的水和1 mL水饱和的正辛醇加入其中，涡旋振荡5min，静置5min分层，2000r/min离心分离10min，分别取有机相和水相各0.1mL测计数，重复六次，至正辛醇相和水相的放射性比值为一恒定值。第二部分 脑18FAV-45 PET显像剂的相关研究1、 脑18FAV-45 PET显像剂的体外稳定性试验将标记好的反应液室温放置1 、 2 、 3 、 4 、 5小时分别测标记率，观察其稳定性。2、 脑18FAV-45 PET显像剂的小鼠体内分布及初步药代动力学实验ICR

58、小鼠随机分组，尾静脉注射0.2ml 脑18FAV-45 PET显像剂，分别于注射后不同时间断头处死小鼠，分别取血、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、性腺、肌肉、骨，称重，计数cpm；解剖脑部，取大脑皮层（额叶、顶叶、颞叶、枕叶）、纹状体、海马、小脑、丘脑、脑桥、以及余脑，称重，计数cpm；每次同时测定标准源的总放射性计数cpm，分别计算每克组织百分注射剂量率（% ID/g）。计算式如下：%IDg-1=组织器官(cpm)组织器官重量(g)标准源(cpm)100%尾静脉注射小鼠，分别于不同时间断尾取血，测定血液的每分钟放射性计数cpm，准确称重，换算为每克血液的每分钟放射性计数，绘制时间-放射性曲线，用

59、软件拟合曲线方程。计算t1/2a、t1/2b、CL等药代动力学参数。3、血浆蛋白结合率测定血浆中加入标记物脑18FAV-45 PET显像剂，37水浴1.5h，加三氯乙酸沉淀，离心。重复洗23次。上清和沉淀分别测计数。血浆蛋白结合率=沉淀放射性计数/上清放射性计数+沉淀放射性计数4、放射自显影分析（1）实验组：正常大鼠静脉注射一定量的生理盐水和脑18FAV-45 PET显像剂对照组：正常大鼠静脉注射一定量的A蛋白调节剂和脑18FAV-45 PET显像剂适宜时间将大鼠颈部放血处死，取脑，冷冻切片，用Cyclone 磷屏成像系统曝光后，观察大鼠脑内A蛋白的分布情况，用相关分析软件进行放射自显影分析。

60、（2）体外培养放射自显影分析将正常大鼠脑部切片经过复温等处理后，实验组加一定量的生理盐水和脑18FAV-45 PET显像剂，对照组加一定量的A蛋白调节剂和脑18FAV-45 PET显像剂，孵育。微量振荡器反复洗涤，放射自显影分析。（3）体内体外放射自显影结果对比。5、动物体内急性毒性研究（1）实验方法选择健康小鼠，给药前禁食6-12小时，给受试物后再禁食3-4小时，采用尾静脉注射方式，用固定剂量法（Fixed-dose procedure）进行研究，从低剂量给药，每组6只小鼠(雌雄各半)，48 h观察动物出现的反应，同时设空白和/或溶媒（辅料）对照组。急性毒性试验的一般观察和指征参照文献：Lo

61、uis C D, Hayes A W. Acute toxicity and eye irritancy. In: Hays A W edited, Principles and methods of toxicology. Fourth edition, 2001: 853-916，对每只动物均应仔细观察并详细记录各种毒性反应出现和消失的时间、严重程度，观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为，如眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等，对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给予受试物前、后，动物死亡及试验结束时应称取动物的体重，观

62、察期间可多次称重）等。所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检观察，出现体积、颜色、质地等改变的何组织器官，均应记录并进行组织病理学检查。 （2）结果处理和分析 根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的剂量反应及时间反应关系。 判断出现的各种反应可能涉及的组织、器官或系统根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官根据不同剂量组各种毒性反应及发生率、动物死亡情况等，确定动物对受试物的无毒性反应剂量和严重毒性反应剂量。应采用合理的统计学方法对LD50进行求算第三部分 脑

63、18F-THK523 PET显像剂的制备及生物学研究（参见第一部分）第四部分 脑18F-THK523 PET显像剂的相关研究（参见第二部分）第三部分 AD动物模型的建立及行为学和分子影像评价1.1 实验动物健康成年Sprague-Dawley大鼠(复旦大学实验动物房)，均为雄性，体重180-210 g(平均(19812)g)。正式试验前。对大鼠进行Morris水迷宫检测，由2个象限找到平台的潜伏期大于120 s大鼠为先天愚钝鼠，被淘汰正常大鼠用于试验。猴体内显像研究1.2 AD大鼠模型制备A蛋白溶于无菌生理盐水(2g/L)，37孵育1周以上，使其变为聚集状态的A。大鼠经10水合氯醛腹腔麻醉(003 ml/kg)，固定于立体定位仪上，常规备皮消毒，颅顶部正