黑曲霉利用五倍子生料固体发酵产单宁酶优化发酵条件研究

《黑曲霉利用五倍子生料固体发酵产单宁酶优化发酵条件研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《黑曲霉利用五倍子生料固体发酵产单宁酶优化发酵条件研究（8页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、黑曲霉利用五倍子生料固体发酵产单宁酶优化发酵条件研究 摘 要:单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase, EC31111120),它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键,生成没食子酸和葡萄糖。主要来源于微生物,存在于细胞内和细胞外,目前研究得较多较为深入的是青霉和黑曲霉。本实验对五倍子生料固体发酵产单宁酶进行了研究,发酵条件的单因素优化后得到:初始水分含量80%,接种量1%, 20%五倍子,温度30e为最佳产酶条件。在此基础上,利用正交实验对显著影响产单宁酶的培养基及培养条件因素进行优化,得到固体发酵黑曲霉诱变菌株最佳产单宁酶条件为:湿度80%、接种量1%、发酵温度33e、五倍子含量15%

2、。其中温度对黑曲霉产单宁酶酶活性的影响是显著的,并测得在此最佳发酵条件下产单宁酶活性达57132U/gds。关键词:单宁酶;黑曲霉;固体发酵;优化Optim ization of the production of tannase byAspergillusnigersolid-state fermentation using gallnutSHIRu-i li1,2, QIU Shu-yi1,2, LIYang-zhen1,2, ZHANG YI-m ing1,3(1. Guizhou ProvinceKeyLab ofFermentation Engineering and Biopham

3、acy, Guiyang 550003;2. ChemicalEngineeringCollege, GuizhouUniversity, Guiyang 550003)Abstract:The systematic name ofTannase is tannin acylhydrolase (Tannase, the EC 31111120); it can hydrolysesthe ester and depside bonds of gallotannis and gallic acid esters to form glucose and gallic acid.Tannasewa

4、smainlyproduced bymicrobiology, existing inside and outside of the cel.l Penicillium andAspergillusNigerwere mostly stud-ied. This experimentwas focused on optimizing fermentation conditions byAspergillusNigerin solid-state fermentationusing gall nuts as substrate. The initialmoisturewas 80%, the in

5、oculum 1% and the 30 C was the best conditions bythe single factor optimization experiment. Furthermore, orthogonal optimization of themedium and the culturewas per-formed and the best conditions ofproducing tannase by solid fermentationwere: the initialmoisture content80%, theinoculum 1%, the tempe

6、rature 33eand the gallnuts15%. Among them, the temperature had a remarkable effectonTannaseactivities. The activity ofTannasewas up to 57132U/gds under the above condition.Key words:Tannase; AspergillusNiger;solid fermentation; optimization收稿日期:2009-02-25基金项目:贵州省科学技术基金,黔科合J字2008 2091号。作者简介:石瑞丽(1985-

7、),女,河南许昌人,在读硕士研究生,研究方向为发酵工艺。中国食品添加剂China FoodAdditives试验研究108 单宁酶(Tannase, EC 31111120)是一种水解酶,全称单宁酯酰水解酶,能水解没食子酸单宁中的酯醚和缩酚酸键生成没食子酸和其他化合物,也能水解没食子酸甲酯类物质1。几十年来科学家发现,能够产生单宁酶的菌种十分丰富,除了传统的曲霉、青霉、酵母,还有寄生内座壳菌、巴斯德菌、茄形镰刀菌和绿色木霉。这些菌种都是以单宁作为诱导物来产生单宁酶的,充分证明了单宁酶为一种诱导酶。除存在于富含单宁的植物例如茶叶提取物中外,还广泛存在于微生物中,如真菌类的曲霉(Aspergill

8、us)、青霉属(Pen-icillium)、根霉属(Rhizopus)以及毛霉属(Mucor)。单宁酶不仅分布广,而且用途也较多。在酶制剂工业发达的国家,如日本、美国,单宁酶的基础理论和应用研究工作开展得较早,并已在茶饮业中取得了较好的经济效益2-4。随着不断的发展,单宁酶在精细化工、皮革、饲料、化妆品等方面也得到了重要应用,特别是制备药用中间体没食子酸和食品抗氧化剂没食子酸丙酯(PG),以及在处理茶叶的/冷后浑0和啤酒沉淀等方面,有重要应用价值5。五倍子中的主要有效成分为鞣质和没食子酸。鞣质又叫单宁酸,它是倍酰葡萄糖的混合物,即葡萄糖上的羟基与没食子酸形成的酯类化合物的混合物,属于水解类鞣质

9、。五倍子中鞣质含量高达70%以上6。单宁酶是一种诱导酶,因此,当富含单宁酸的五倍子作为一种基础培养基,则能够很好地诱导黑曲霉生产单宁酶。本实验采用五倍子生料进行发酵,即对其培养基不经过灭菌而直接进行发酵,是对灭菌情况的一种创新,既节约了能量、资金,又节省了时间,操作简便。我国直到20世纪90年代才开始进行单宁酶的研究,至今对单宁酶的基础理论研究报道仍很少。在新的高产单宁酶菌株筛选、发酵生产工艺,特别是固体发酵生产工艺的优化、单宁酶发酵生产的诱导底物选择及优化培养基组成的研究等方面,我国还与国外存在一定的差距。本实验采用五倍子生料固态发酵法黑曲霉产单宁酶,并对其培养基及培养条件进行单因素实验研究

10、,同时采用正交方法优化了固体发酵产酶的工艺条件,从而确定最佳发酵条件,增加酶产量、提高酶活、缩短发酵时间,降低生产成本。1 材料与方法111 材料11111 菌种黑曲霉B-0201 (Aspergillus niger),由贵州省发酵工程与生物制药重点实验室紫外诱变原始黑曲霉菌株筛选出来,菌种在4e条件下保存在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基(PDA)上。11112 固态发酵培养基五倍子、麸皮混合物共5g,无机盐溶液(1%(w/v)NH4NO3+011% MgSO4#7H2O +011%NaCl)5mL。112 仪器设备722S分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;精密酸度计PHS-3C:上海虹益仪

11、器仪表有限公司; MJ-160B-II霉菌培养箱:上海跃进医疗器械厂; 100500LL微量进样器:上海求精生化试剂仪器有限公司; FA1004电子天平:上海良平仪器仪表有限公司; DZKW -4电子恒温水浴锅:上海科析试验仪器厂; ZHWY-111B恒温培养震荡器:上海智城分析仪器制造有限公司113 方法11311 黑曲霉B-0201孢子菌悬液的制备黑曲霉B-0201菌株在无菌操作台中接种于马铃薯琼脂斜面培养基上, 30e恒温培养4天,待孢子成熟后,加入适量无菌生理盐水,在酒精灯旁用接种环刮下孢子,置于装有玻璃珠的三角瓶中, 30e震荡培养1h,使孢子充分分散。取1mL孢子悬液进行梯度稀释并

12、镜检计数。在移入发酵锥形瓶之前,将孢子悬液稀释至11109个/mL。11312 固体发酵培养基的制备及培养取五倍子和麸皮作为培养基基础。由NH4Cl1% (w/v), MgSO4#7H2O 011% (w/v), NaCl011% (w/v)组成培养基的无机盐溶液。取5g五倍子及麸皮的混合物装入250mL三角瓶中,加入5mL上述无机盐溶液和3mL蒸馏水,用移液管吸取1mL黑曲霉孢子悬液(11109个/mL孢子)移入三角锥瓶中,用玻璃棒充分搅拌使孢子与培养基混合均匀,用八层纱布包扎好,不进行灭菌,试验研究中国食品添加剂China FoodAdditives109 直接放置于30e的恒温培养箱中培

13、养96h。11313 粗酶液的提取取出恒温培养箱中已培养96h的产单宁酶的固体培养基,加入50mL pH=510的柠檬酸缓冲液,用玻璃棒搅拌均匀,包扎好,放置于180r/min、30e摇床培养箱上培养1h后取出,用定性滤纸过滤,滤液即为粗酶液。11314 单宁酶酶活力的测定7参考文献7测定单宁酶活力的方法测定。将单宁酶在pH510, 30e条件下每分钟产生1Lmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。2 结果与分析211 发酵温度的选择基础发酵培养基中接入黑曲霉No121孢子悬液1mL (11109个/mL孢子),用玻璃棒搅拌均匀,包扎好后放入恒温培养箱中培养,分别控制温度为25e、3

14、0e、33e、37e、40e,培养96小时后,加入PH=5的柠檬酸)柠檬酸钠缓冲溶液50mL,搅拌均匀后放入30e、180r/min的摇床上震荡培养1h,然后用三角漏斗过滤发酵液,弃滤渣取滤液作为酶液,测定单宁酶酶活力。由表1可以看出,随着发酵温度的增加,单宁酶的活性呈现先增大再减小的趋势,且在发酵温度为30e时达到最大值。因此选择30e为单宁酶固态发酵的最佳温度。表1 发酵温度对产酶的影响Table1 Effect of ferm entation temperatureon enzym e production项目温度/e25 30 33 37 40单宁酶活性/(Ugds)17127 35

15、126 34113 28117 19119212 接种量的选择基础发酵培养基中分别接种入015mL 11109个/mL, 1mL 11109个/mL, 115mL 11109个/mL, 2mL 11109个/mL, 1mL 1109个/mL, 1mL 1108个/mL, 1mL 1107个/mL,1mL 1106个/mL的黑曲霉孢子悬液,其他条件不变,用玻璃棒搅拌均匀,包扎好后放入30e恒温培养箱中培养96h后,加入pH=5的柠檬酸)柠檬酸钠缓冲溶液50mL,搅拌均匀后放入30e、180r/min的摇床上震荡培养1h,然后用三角漏斗过滤发酵液,弃滤渣取滤液作为酶液,测定单宁酶酶活力。由表2可知

16、,加入1mL 11109个/mL孢子悬液时,菌丝生长较快,单宁酶活力达到最大。当接种量太小或太大时,菌丝生长缓慢,延长了生长周期,单宁酶酶活均有所降低。因此,选择1mL 11109个/mL孢子悬液为固态发酵的最佳接种量。表2 接种量对产酶的影响Table2 Effect of ferm entation temperature on enzym e production项 目接种量/ (个/mL)111091109110811071106015mL 1mL 115mL 2mL 1mL单宁酶活性/ (Ugds) 26159 30147 25116 23127 26121 18157 16123

17、18100213 五倍子含量的选择五倍子的添加量分别为5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%,其余组分不变,然后接种入No121孢子1mL (11109个/mL孢子),用玻璃棒搅拌均匀,包扎好后放入30e恒温培养箱中培养96小时后,加入pH=5的柠檬酸)柠檬酸钠缓冲溶液100mL,搅拌均匀后放入30e、180r/min的摇床上震荡培养1h,然后用三角漏斗过滤发酵液,弃滤渣取滤液作为酶液,测定单宁酶酶活力。由表3可知,当五倍子含量为20%时单宁酶的酶活最高,约为25U/gds。当五倍子含量过高或过低都将影响单宁酶的酶活,原中国食品添加剂China FoodAdditives试验研究1

18、10 因可能是由于随着五倍子含量的增加,培养基中pH值减少影响单宁酶的产生和活性。因此,五倍子的添加量最优为固体培养基的20%,即为1g。表3 五倍子含量对产酶的影响Table3 Effect of different content ofgallnut on enzym e production项目五倍子含量/%5 8 10 15 20 25 30单宁酶活性/(Ugds)1213 1812 2113 2314 2510 2113 1616214 初始水分含量的选择调整基本发酵培养基中水分添加量为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%其余组分不变,然后接种入No121

19、孢子1mL (11109个/mL孢子)后,用玻璃棒搅拌均匀,放入30e恒温培养箱中培养96h后,加入pH=5的柠檬酸)柠檬酸钠缓冲溶液100mL,搅拌均匀后放入30e、180r/min的摇床上震荡培养1h,然后用三角漏斗过滤发酵液,弃滤渣取滤液作为酶液,测定单宁酶酶活力。由表4可知,初始水分含量为80%时单宁酶酶活最高, 80% 100%单宁酶的酶活相当,说明80%为饱和湿度。因此,初始水分含量应为80%。表4 初始水分含量对产酶的影响Table4 Effect of initialmoisture contenton enzym e production项目初始水分含量/%30 40 50

20、60 70 80 80 100单宁酶活性/ (Ugds)1915 2215 2414 2619 3112 3813 3719 3716215 正交实验在单因素实验的基础上,选择单因素实验中得出的最优水平为正交实验的中心水平,即选取每个单因素对黑曲霉产单宁酶酶活影响出现拐点的左右水平和拐点水平,共3个水平作为水平参数进行正交实验。以单宁酶的活性为指标,进行L9(34)正交实验。正交实验的因素和水平的选择见表5,正交实验结果见表6,运用正交设计助手V311专业版对结果进行分析,得出五倍子生料发酵产单宁酶的最优条件。表5 正交实验因素和水平设计Table5 design of orthogonal

21、experim entalfactors and levels水平湿度/%接种量/mL温度/e五倍子含量/%1 70 015 25 152 80 1 30 203 90 115 33 25表6 发酵工艺条件正交实验结果与直观分析Table6 Result and intuitional analysis of orthogonal experim ent of the technique condition of ferm entation实验湿度/%接种量/%温度/e五倍子含量/%实验结果/ (U/gds)NO1 1 1 1 1 37120NO2 1 2 2 2 38171NO3 1 3 3

22、 3 47149NO4 2 1 2 3 42183NO5 2 2 3 1 58143NO6 2 3 1 2 41120NO7 3 1 3 2 43140NO8 3 2 1 3 34131NO9 3 3 2 1 42177均值1 (K1) 411133 411143 371570 461133均值2 (K2) 471487 431817 411437 411103均值3 (K3) 401160 431820 491773 411543极差(R) 71327 21677 121203 51030试验研究中国食品添加剂China FoodAdditives111 表7 正交实验结果的方差分析Tabl

23、e7 Variance analysis of orthogonal experim ent因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性湿度/% 941992 2 11000 91000)接种量/% 141311 2 11000 91000)温度/e2331372 2 161307 91000五倍子含量/% 461563 2 31254 91000)误差14131 2从表6可知,多因素多水平对单宁酶酶活也有很大的影响,根据实验因子的总计数和平均数可以看出: A取A2, B取B2, C取C3, D取D1为好,即A2B2C3D1组合。同时由R极差分析得出,各因素对发酵条件影响的主次关系为RCRARDRB

24、,发酵温度对单宁酶的活性影响最大,结合实验结果, No5实验号与正交实验基本吻合,所以取No5实验号。即利用黑曲霉对五倍子产单宁酶提高酶活的最佳发酵生态条件为湿度80%、接种量1%、发酵温度33e、五倍子含15%。由直观分析表可以确定发酵条件的最优组合为实验No5。由表7正交实验的方差分析结果可知,在接种量存在一定误差的情况下,取P=011,温度大于F0105,即F温度F温度临界值,温度对黑曲霉产单宁酶酶活性的影响是显著的,说明实验结果具有一定的科学性。根据最佳发酵条件进行了验证性实验,在此条件下进行固体发酵重复实验,酶活力为57132U/gds。3 结论分别从湿度、接种量、发酵温度、五倍子含

25、量等不同的单因素发酵条件方面对黑曲霉单宁酶产酶条件进行了研究,优化了产酶条件。结果表明用改方法产单宁酶的最适发酵条件为:温度30e,接种量1%,五倍子含量20%,湿度80%,并对该四因素三水平做正交实验,得出最优化结果:湿度80%、接种量1%、发酵温度33e、五倍子含量15%。根据最佳发酵条件进行了验证性实验,在此条件下进行固体发酵重复实验,酶活力为57132U/gds。中国的酶制剂工业起步较晚,无论是在酶的理论研究、开发应用还是在酶的生产技术和生产规模上都远远落后于酶制剂工业发达的国家,所以,开发新酶及酶的多种用途,提高酶的生产技术,使之更好地为工农业及医疗环保事业服务,已成为酶学研究的一个

26、重要任务.单宁酶的应用范围十分广泛,然而单宁酶的研究在我国尚属起步阶段,鉴于它的多种用途,加强对其理论研究并使之转换为生产力,既可为其他新酶的开发利用提供有价值的参考,又将带来可观的利益。参考文献:1 KenjiAok,i Ryu Shlnke, HiroshiNishira. Purification and someproperties of yeast tannase. Agri Biol Chem, 1976, 40 (1):79-852 Lekha P k, Lonsane B K. Comparative titres, locateon andproperties of tann

27、in acyl hydrolase produced by AspergillusNigerPKL 104 in solid-state, liquid surfase and submerged fermenta-tions J. ProcessBiochemistry, 1994, (29): 4973 CristbalNo Aguilar, ChristopherAugur. Induction and repres-sion patterns of fungal tannase in solid-state and submerged cu-ltures J. ProcessBioch

28、emistry, 2001, 36 (6): 565-5704 CruzHernandez, M Augur. Evaluation of culture conditions fortannase production byAspergillusnigerGH1 J. Food techno-logy and biotechnology, 2006, 44 (4): 1330-98625贺筱蓉,肖海军.单宁酶及其研究进展J.浙江教育学院学报, 2002, (3)6朴春梅.五倍子的研究近况J.中国民间疗法, 2005, 13(2), 63-657保玉心.一种胞外单宁酶的活力检测方法J.精细化工,2008, 25 (6)