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1、实验 十细胞的原代培养一、实验目的1、了解细胞体外培养的原理、基本方法。2、掌握无菌操作方法及注意事项。3、学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。二、实验原理模仿体内生长环境， 使来自机体的细胞、 组织、器官能够在人工培养条件下生存、 生长、繁殖。三、实验器材1、纯水设备：纯水仪2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器及0.22 m 滤膜；3、超净工作台4、培养设备： 普通培养箱、 CO2 培养箱；5、贮存设备：冰箱、液氮罐6、观察设备：倒置显微镜7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等培养主要用品1 、培养瓶、皿：以玻璃器皿为主 ,应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品（1）培养瓶（
2、2）培养皿2、血球计数板3、眼科剪、镊；实验材料714 日龄鸡胚（肝素）抗凝血原代培养材料选择 幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养 分化程度低的组织比分化高的容易培养 肿瘤组织比正常组织容易培养。实验试剂1、D Hank液 KH2PO4 0.06g, NaCI 8.0g, NaHC03 0.35g, KCI 0.4g,葡萄糖 1.0g,Na2HPO4?H2O 0.06g 力卩 H20 至 1000ml注：Hank液可以高压灭菌。4 C下保存。2、o. 25%胰蛋白酶（D Hank液配）3、M199 培养液4、小牛血清5、青、链霉素6、5NaHCO3、 2碘酒7、75酒精8、洗液
3、：由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成四、实验方法与步骤一）培养前的准备工作1、用品清洗与消毒2、溶液配制与消毒（1） 培养液、酶、抗生素等生物活性成分需过滤消毒（2）平衡盐等高压蒸汽消毒3、预热溶液4、工作间及超净台消毒：紫外线、消毒液。5、洗手和着装6、进入无菌室7、关闭超净工作台内的紫外光灯 ,点燃酒精灯 （一切操作均需在酒精灯火焰下进行 ） 将消毒过的所用物品放入超净工作台中组织块培养法培养鸡心肌细胞步骤1、配M199完全培养液：M199基础培养液90小牛血清10 青霉素100IU/ml链霉素过滤除菌。100 g/ml2、获取心脏 消毒鸡胚蛋：泡入 70酒精 取出鸡胚，Hank
4、液洗涤。 取出心脏，放入Hank液中3、处理心脏1、Hank液漂洗心脏2、剪成约 1 mm3 大小的小块。3、洗组织块。Hank液洗一次，培养液洗一次4、摆放：间隔 2cm5、贴壁。6、加培养液培养分离细胞培养法培养鸡表皮细胞步骤（一）胰酶消化法1 、消毒、取材2、洗涤：用DHank s液洗涤三次。3、在小青霉素瓶中用手术剪将组织块剪成小块 （1mm2），再用Hank液洗三次4、视组织块量加入56倍的0.25%胰酶液，37C中消化2040分钟，每隔5 分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。5、加入 35ml 培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂） 。6、 静置 5 分钟，使未分散的
5、组织块下沉，取悬液加入到离心管中，1000rpm 离 心 8 分钟，弃上清液。7、加入Hank液2ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。8、加入培养液I 2 ml （视细胞量），血球计数板计数。9、将细胞调整到5X 105/mI左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37C下培养。五、注意事项1 、操作前要洗手，进入超净台后手要用 75%酒精或 0.2%新洁尔灭擦试。试剂等 瓶口也要擦试。2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器 械烧灼时间不能太长， 以免退火， 并冷却后才能夹取组织， 吸取过营养液的用具 不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。5、瓶子开口后要尽量保持 45斜位。6、吸溶液的吸管等不能混用。7、 严格无菌操作。自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。（细胞计数可 在有菌环境中进行。 ）8、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 注意黏附。结果观察1 、植块培养：培养 2 3 天，细胞从植块向外迁移，随着培养时间延长，在植块 周围形成一圈细胞 “晕”，称之为生长晕 （growth hallow） 。2、离散细胞培养：有单细胞贴壁或分裂成片
细胞的原代培养实验报告
