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1、单细胞 RNA 测序的样本制备指南在开展单细胞 RNA 测序之前，我们首先要妥善地制备 单细胞样本。这虽然有点困难，但本文介绍了一些诀窍和建 议，也许对您的实验有所帮助。 这主要适用于 10 x Genomics 的 Chromium? Single Cell 3 Solutic 不过也同样适用于其他方案。 单细胞 RNA 测序( scRNA-seq )是一种强大的 工具，让研究人员能够揭开复杂的生物学系统，分析各个细 胞的基因表达动态，从而深入了解疾病发展过程中的细胞进 程。在此之前，分析混合细胞群体的基因表达一直是一项困 难的任务。当然，在开展单细胞 RNA 测序之前，我们首先要妥善地制
2、备单细胞样本。这虽然有点困难，但本文介绍了一些诀窍和 建议，也许对您的实验有所帮助。这主要适用于 10 xGenomics 的 Chromium? Single Cell 3 Solution ，不过也同样适用于其他方案。了解您的样本样本制备的具体方案因样本类型而异，但无论 采用哪种方案，您都必须要确保上样的细胞是有活力的，并 且完全解离成单细胞。无论是细胞系还是组织，优化细胞解 离的操作都是必不可少的，这样才能避免细胞死亡和裂解。 死细胞会裂解，释放出 RNA 。这种游离 RNA会增加背景噪 音，影响单细胞数据的质量。目前有不少现成的样本制备方案，但也许需要针对您的样本 类型来修改。比如，悬
3、浮细胞系、磁珠富集的细胞和流式分 选的细胞已经呈悬浮状态，只需要洗涤和计数即可。不过， 如果样本换成了组织，那就有必要精心优化解离操作，以确 保数据质量最高。另一个需要考虑的因素是不同类型的细胞在 RNA 含量上相 距甚远，而准确测定此参数将影响一些关键决定，比如文库 制备过程中的 PCR 循环数。举个例子，人外周血单核细胞(PBMC )的 RNA 含量极低，只有 0.75 pg/细胞，而 HCC38 细胞系则富含 RNA，含量达到 21.6 pg/细胞。处理也要小心移液相信大家都对自己的移液技术充满信心， 不过，在处理解离的组织或悬浮的细胞时， 还是要格外小心。 比如，当细胞静置在管中时，它
4、们开始沉降，因此每次从管 的上部或下部吸取时，有可能吸到不同数量的细胞。正确的 做法是每次移液之前先混合细胞悬液，然后从管的中部吸取。 同时，细胞必须被温柔对待。大家可能不知道，即使用宽口 径的移液吸头，移液混合也会对样本质量产生负面影响。下 图比较了在 HEK293T 细胞上开展的四种不同的细胞混合实 验对单细胞数据的影响。剧烈的移液混合和涡旋振荡都会导 致细胞过早溶解， 释放出RNA ，形成背景噪音， 最终降低细 胞的 reads 比例。正确的做法是使用宽口径的吸头来轻柔混 合细胞悬液。 洗涤在处理悬浮细胞、 解离组织或大量细胞时， 强烈建议彻底洗涤。这可以根据样本类型以及scRNA-se
5、q 方法来调整。建议的洗涤方案是用含有 0.04% BSA 的 PBS来沉淀和重悬细胞两次，然后用最终体积的 PBS 和 0.04% BSA 来重悬细胞。 过滤大的细胞团块或细胞碎片会增加微流体芯片的堵塞风 险。为了避免这种状况， 建议在上样之前使用细胞滤网 ( cell strainer ),孔径大约为 30-40 卩 m。不过需要注意的是，每次 过滤都会造成细胞悬液体积的损失以及细胞浓度的改变。因 此，如果需要过滤，在过滤之后应该对细胞重新计数。 细胞计数和活力评估在洗涤和过滤之后，我们有必要测定细 胞活力，以便评估样本质量。尽管方法很多，但简单的台盼 蓝染色方法就不错，能够鉴定出活细胞和
6、死细胞的比例。此 外，我们还需要开展细胞计数，准确了解样本中有多少个细 胞。血细胞计数器当然可以用， 不过还有更方便的计数工具， 如赛默飞的 Countess II FL 全自动细胞计数仪。 影响细胞计数准确性的一个重要因素是细胞储液的浓度。研 究发现， 细胞储液的浓度在 700-1200 个细胞/卩的范围内是 最理想的。超出这个最佳范围，可能导致细胞计数的结果不 可靠。如果样本不在这个范围内，建议相应地调整细胞储液 的浓度。 去除死细胞样本中高比例的死细胞可能会影响目标细胞的 回收率。死细胞及其他污染物的去除对获得高质量的数据至关重要。当然，样品中的死细胞比例可能差异明显，这要取 决于样本类
7、型和制备方法。对于死细胞比例较高的样本，您 可以参考 10 x Genomics的技术指南( Removal of Dead Cells from Single Cell SuspensionsImproves Performance for 10 x Genomics? Single Cell Applications )。样本保存为了尽量避免转录组的变化，在洗涤和计数之后， 单细胞的悬液应保存在冰上，等待后续的文库构建。在理想 情况下，一旦样本制备好，应尽量在 30 分钟内使用。 不过，样本在冰上具体能放多久，这也关乎到细胞类型。有 些细胞(如 PBMC )如果长时间放在冰上，就会形成团块。 这些团块很难解离，增加了堵塞芯片的风险，而且每个团队 都被当成一个细胞， 又降低了计数的精确性。 在这种情况下， 我们应当尽量缩短放置的时间。结语在制备单细胞悬液时，提前规划和精心准备是必不可少 的，因为全面考虑各种因素， 才有望获得高质量的数据。 10 x Genomics 等公司提供了单细胞样本制备的许多指导，也提 供了特定细胞类型的示范方案。如果您的研究对象难以分离 到完整细胞，则可以选择新近开发的细胞核分离方案。
单细胞RNA测序的样本制备指南
