第12章基因克隆和DNA分析的利用

《第12章基因克隆和DNA分析的利用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第12章基因克隆和DNA分析的利用（16页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、第 12 章 Chapter 12基因克隆和 DNA 分析的利用（Make use of gene cloning and DNA analysi）为了保持身体健康，我们的饮食中必须含有一定的营养物质。其中一种营养物质是维生素 A,存在于鸡蛋、油性鱼类、肉类和牛奶中。如果人们不进食这些食物，那么他们体内就缺乏维生素A。不过，水果和蔬菜中含有3胡萝卜素，可以在体内转化成维生素A。如图1中的儿童，全世界有数百万人主要食用精大米（这种大米不像糙米，米粒表面的外皮已经被除掉）。 精大米既不含有维生素 A也不含有3胡萝卜素。因此食用大米的人普遍缺乏维生素A。结合数据来看，世界卫生组织（ WHO）估计有1

2、亿儿童缺乏维生素，导致每年50万儿童失明。图1不发达国家的家庭依靠大量的精大米为食物。虽然精大米内含有碳水化合物，是重要的能量来源，但是精大米不含维生素A或3胡萝卜素。2000年黄金米首次被研发出来，目的是解决大米中不含维生素的问题。需要能将3胡萝卜素转移到水稻内的酶的编码基因，这样水稻的胚乳，即人们可以食用的发光的白色部分作为大米，就含有了3胡萝卜素。当人们从食物中吸收了3胡萝卜素时，人体可将3胡萝卜素转化为维生素 A,避免发生维生素 A缺乏症。研发黄金米的科学家打算把这些水稻 种子免费送给农民，因为这些大米对大众来说很有益，这样他们的研究工作就得到了广泛的支持。尽管如此，仍然有很多人反对他

3、们的工作。如你想了解这些反对意见以及科学家团队针对某些科研问题的后续工作，你可以访问www.goldenrice.org.转基因生物对人类有益Transgenic organisms can be useful to humans转基因生物是包含外源基因的生物。你可以看一下第11章中基因如何转移到细菌细胞中，产生转基因细菌。当一个基因成功转移到另一个生物体时，这个转基因生物就会产生转基因编码的蛋白质。从转基因生物中收集人类蛋白Collect ing huma n prote ins from tran sge nic organi sms许多人类的疾病是由于无法生成某一种关键蛋白质造成的。例如

4、，II型糖尿病（208页）是由于无法产生胰岛素造成的，血友病（115页）是由于无法产生关键凝血蛋白造成的。如果编码某种蛋白质的基因成功转移到转基因生物内，可以提取出所产生的蛋白质，用于治疗相关的疾病。下页中表 1列举了一系列已经用于大规模生产人类蛋白质的转基因生物。如果转基因生物将人类蛋白质分泌到其生长的发酵液中（下页图2）或牛奶中，那么就更容易提取了。表1中列举了微生物和哺乳动物中存在的人类蛋白质可以说明这一点。植物无法大量分泌蛋白质，如果我们知道植物的哪个部分产生蛋白质，那么从植物中提取人类蛋白质就更加容易了。科学家认为，通过将人类基因转移到转基因生物基因组的特殊部分，可以确保将人类蛋白质

5、分泌到牛奶中或只存在植物种子中。通过把基因放置在哺乳动物控制哺乳期的启动子下游，或控制植物产生种子的启动子的下游，科学家可以控制转基因生物产生人类蛋白质的位置。利用转基因农场动物（有时称为农业医药）和转基因植物生产药物成为越来越重要的新药生产来源。问题1:与真核生物不同的是，细菌DNA不含有内含子。a）请阐释通过插入互补 DNA （cDNA）而不是复制基因的方式改变细菌的优势。b）请阐释使用转基因酵母菌生产人类蛋白质而不使用转基因细菌生产的一个优势。转基因生物人类蛋白蛋白质的临床应用细菌a -1-抗胰蛋白酶治疗肺气肿生长激素治疗矮小症胰岛素治疗1型糖尿病酵母菌a -1-抗胰蛋白酶治疗肺气肿植物

6、胶原蛋白修复外科手术生长激素治疗矮小症白细胞介素P治疗癌症疫苗预防麻疹奶牛纤维蛋白原治疗凝血障碍羊抗凝血酶因子治疗深静脉血栓猪凝血因子VHI治疗血友病表1已用于大规模生产人类蛋白质的转基因生物。更多的转基因生物处于生产的临床前试验阶段。图2这些大型工业发酵罐包含一个生产人类蛋白质的转基因细菌培养基。由于细菌分泌人类蛋白质，因此从培养液中提取出人类蛋白质相对容易。转基因植物可生成转基因（ GM）食物（Transgenic plants produce genetically modified （GM） food）除了用于制造人类蛋白，对植物中基因转移的研究专注于提高植物产量。尤其是专注于两种植物

7、特性：抗杀虫剂和抗除草剂。一类土壤细菌根瘤农杆菌，对于将新基因转移到作物植株 内尤其重要。图3阐释了细菌如此重要的原因。根瘤农杆菌产生化学物质使细菌能够抵抗虫害。成功把从产生自然杀虫剂的编码基因细菌转 移到玉米植株内，减少抗病虫农药的需要。1995年，玉米成了第一个上市的抗杀虫剂的转基因农作物，随后转基因马铃薯和棉花也上市了。 如今在全世界有很多相互竞争的农用化学 品公司，上市了多种类型的能产生杀虫剂的转基因农作物。图3这种对植物的破坏被称为根瘤。是由于一种叫根瘤农杆菌的细菌感染植物引起的。当根瘤农杆菌引起植物细胞，其感染自己的质粒，T-质粒，植物细胞注入自己的 DNA。生物学家把基因插入到T

8、-质粒中就能够把外源基因转移到植物体内。到目前为止，还没有生产出一个可以抵抗周围杂草生长的植物。不过，转基因植物已经用于抵抗最常用的除草剂， 草甘膦（商品名为农达）。草甘膦通过抑制植物利用该酶产生必要 氨基酸酶（EPSP酶）的方式来抑制杂草的生长。没有这种功能性EPSF酶，杂草植物无法产生其所需的某些蛋白质而死亡。不幸的是，用于除草喷洒的除草剂也同样会杀死农作物。解决这一问题的办法是给农作物体内转移一种细菌基因，使其具有抵抗草甘膦的能力。这种抗除草剂的作物（成为抗农达作物）在许多国家得到常规种植。转基因植物产生的食物通常被称为转基因植物（GM植物）。人们希望通过转基因植物提高农作物产量，帮助减

9、少世界范围内的饥饿问题。你可能支持这个目标， 减少世界范围内的饥饿，但是你喜欢转基因食物吗？这个问题在英国引起了很大争议。在英国，政府立法禁止转基因植物的生长，任何转基因植物生产的食物必须贴明显的转基因标志。很多人拒绝购买转基因食物，并且当他们发现加工的食物成分中含有转基因产品时非常气愤。有些人如图4中的激进分子，当发现转基因作物时，采取极端行动破坏转基因试验作物。人们对转基因食物的关注主要集中在以下三个领域。食用转基因食物对我们有害吗？ 在英国有非常严格的规定，要求新药物在用于人体前 需要进行试验。有些人质疑，为何在人类食物链的转基因食物使用方面没有相似的严格 规定。转基因作物对环境有负面影

10、响吗？很多人关心破坏病虫可能破坏自然群落。有些人指出使用除草剂似乎增加了抗除草剂转基因作物的生长。其他人则担心在植物种类之间的 水平基因转移会导致转基因作物以外的植物会获取抗除草剂的转基因。图4有些人采取极端手段支持他们的想法。这些激进主义者正在破坏他们认为是转基因植 物的农作物（GM植物）。全球化会破坏当地企业吗？这些担心主要涉及到大型跨国企业的垄断以及其行为对小农场主的影响，而不是转基因科学。 转基因植物的种子由少数跨国公司生产。他们把种子打包销售；农民必须同意从一家公司购买种子、肥料和农药。单一供应商增加了公司对农场主政策改变的风险或国家间的政策联系的改变风险。你可能想讨论转基因的类别问

11、题, 忧不如英国人那么担心。基因治疗用于补充有缺陷的基因 很多人反对生产转基因人的概念,包括为什么有些国家的人对转基因作物和转基因食物的担Gene therapy is used to supplement defective genes 但这是基因治疗所做的。基因治疗的目的是通过为疾病患者提供纠正复制其缺陷基因来治疗遗传性疾病。把矫正基因放入细胞的过程叫做 转染，接受了新基因的细胞叫做被转染。基因治疗有两种方式：体细胞治疗 和生殖细胞治疗。体细胞治疗 Somatic cell therapy在体细胞治疗中，校正后的基因副本被直接插入到患者的体细胞中。在某些时候，体细胞被移除，校正后的基因副本

12、被插入到体细胞中，然后把被转染的细胞放回相同患者的体内。这种方式对血液疾病非常有效，例如白血病，从患者骨髓细胞中提取出细胞，转染再替换。而在其他情况下，大量体细胞无法安全移除，校正后的基因被直接插入到感染的组织中。这种技术被用于治疗肺部疾病，例如囊性纤维化。将校正基因转移到患者细胞内需要载体。逆转录酶病毒 经常被用作骨髓的载体，因为人们发现逆转录酶病毒被成功用于大量干细胞的转染中。病毒，被称为腺病毒也已经被用于治疗囊性纤维化，因为这种病毒有 脂质体一一脂类小液滴，与肺部的上皮细胞表面膜相融合 （图5）。 当骨髓干细胞被转染并被父母的骨髓替代时，其所产生的所有不同类型的白血球将含有增加的基因。这

13、些基因将为白血病等血液疾病提供长期的治疗。当干细胞无法使用时， 校正基因的效果仅能与转染细胞存活的时间一样长。这一点可以解释为什么基因治疗囊性纤维化必须每隔几周必须重新治疗一次。问题2 除了植物染色体中含有 DNA外，叶绿素中也含有 DNA。可以抵抗杀虫剂和除草剂的基因通常被插入到植物的叶绿体中，而非插入到转基因植物的染色体中。说明为什么这些技术可以通过花粉粒降低外源基因的水平转移。IE护叶dw*脂质体liposome肺上皮纟田胞表面膜 surface membra ne of lung epithelial cellDNA 被释放到肺上皮细胞内DNA released into lung e

14、pithelial cell图5脂类小液滴，即脂质体携带囊性纤维化校正基因到达肺上皮细胞。脂质体能够与肺上 皮细胞表面膜融合，从而将DNA释放到细胞中。人们已经尝试使用基因治疗用于癌症的治疗。正如你在第10章所学到的那样，癌症是由于致癌基因激活或肿瘤抑制基因未激活引起的。基因治疗已经用于将激活肿瘤抑制基因的副本 插入到癌细胞中，并试图防止癌细胞中致癌基因的表达。由于缺少确保校正基因能够被癌细胞所接纳的载体，阻碍了该项研究的成功。生殖细胞治疗 Germ cell therapy在生殖细胞治疗中，利用体外受精技术（IVF）把校正基因插入到受精卵细胞中。 一旦受精， 在再次植入母体子宫前，胚胎也可以

15、生长。如果基因转移成功，有丝分裂会确保胚胎的每个 细胞包含一个校正基因副本。作为成年人，转染个体将把校正基因副本遗传给他或她的后代。结果，生殖细胞治疗是遗传疾病的治疗方法，被治疗的患者不仅自身可以持续一生的时间， 而且杂交的后代也得到了治疗。基因筛查和遗传咨询 Medical screening and genetic counselling很多人类疾病是由于基因突变引起的，因此等位基因在这种情况有用，但是在另外一种情况没有用。你在第 5章的例子中已经学过，镰状细胞贫血是由于基因编码了3 -球蛋白（血红蛋白分子中两种多肽的其中一种）的等位基因。在疟疾流行的地区， 这种基因的杂合子具有选择优势，

16、因为这种细胞能够抵抗疟疾。在目前没有疟疾的国家，例如英国，杂合子在这方面处于劣势，因为有些儿童可能是镰状细胞等位基因的纯合子。这些儿童将遭受这些不舒服且具有生命受到威胁的症状。问题4有些人担心生殖细胞治疗技术可能被滥用。说明滥用生殖细胞技术的方式。问题5如何利用生殖细胞治疗技术开发出可以分泌人类蛋白质牛奶的奶牛？如果夫妻意识到他们家族中有遗传疾病，例如镰状细胞贫血，那么他们在打算生育后代的时候可能会担心。他们可能会咨询医生其后代是否会患有遗传疾病。这种咨询被称为遗传咨询。在过去，遗传咨询师能够使用第 4章中的分类信息计算生出受影响的婴儿的几率。例如，利用对单因子杂种遗传的理解，你可以算出两个人

17、均为镰状细胞贫血的杂合子时，他们生出一个镰状细胞贫血婴儿的概率是四分之一（概率为25%）。乳腺癌和卵巢癌 Breast cancer and ovarian cancer在英国，每年大约有 200,000例乳腺癌患者，25,000例卵巢癌被诊断。研究显示大约有 10% 的病例是由于遗传因素造成的。 至少两种基因涉及到乳腺癌的产生： BRCA1（ BRjast CAncer1） 和BRCA2正常情况下，BRCA1和BRCA2基因控制细胞生长，但是这些基因突变增加了患 乳腺癌和卵巢癌的风险。1、BRCA1 和 BRCA2是哪种类型基因？我们每个人都有 BRCA1和BRCA2基因的两个副本，分别从父

18、亲或母亲处遗传而来。如果某 人携带了其中任何一个基因的等位基因突变，那么这个人发生乳腺癌的风险会增加。2、关于BRCA1 和 BRCA2基因的等位基因变异的性质，你可以得出什么结论？表2中显示了英国妇女发生乳腺癌和卵巢癌的风险的数据。3、表2中间一栏是按范围显示患乳腺癌的风险，而右侧一栏是按单一值显示的风险。说明 一下原因。4、总结携带乳腺癌基因变异等位基因对患乳腺癌风险的两点影响。5、说明乳腺癌的患病风险比卵巢癌的患病风险高的原因。患病风险：BRCA1或BRCA2基因的一个变异等位基因的携带者一般人群50岁女性乳腺癌患病率/%33-50270岁女性乳腺癌患病率/%56-87770岁女性卵巢癌

19、患病率/%27-442表2携带BRCA1或 BRCA2基因变异等位基因的女性的癌症患病率与一般人群患病率的对比。 遗传咨询师不仅可以为生育患有遗传疾病儿童的概率提供建议，或为患有遗传疾病的概率， 例如在晚年患有癌症的概率提供建议，而且可以为受到影响的家庭提供精神支持和医疗支持。由于筛查检测结果让人很难做决定，因此需要遗传咨询。例如，一位妇女发现她所怀的孩子患有遗传疾病，她不得不决定是继续怀孕直至生产或是做人工流产。与此相似，一个妇女发现她患有乳腺癌的风险增加了，她可能会决定她是将健康的乳房手术切除这样就不会患乳腺癌了。这两个人做决定都很难，因为他们的决定不仅影响到决定者本人而且会影响家庭的其他

20、成员。 正如你出生后没多久，从足跟采一滴血。这种针刺采血的过程用于检测是否患有一般遗传疾病，例如苯丙酮尿症。这也是医学筛查的一种简单形式。随着DNA技术的发展，越来越多的复杂医学筛查程序发展起来。利用你在第11章中学到的技术，现在可以分析从脸颊内细胞刮片的 DNA,以及母体子宫内胎儿周围羊水细胞或连接着胎儿和胎盘的脐带细胞。DNA杂交和DNA测序是DNA分析中使用的两个重要技术。我们需要看一下这两种技术是如何进行工作的。使用 DNA 杂交找到有害基因 Using DNA hybridisation to find harmful genes如果我们知道有害基因的碱基序列的一部分，如果这个基因在

21、DNA样本中出现，我们可以利用DNA杂交找到这个有害基因。 在杂交前，使用第11章中你学到的技术进行 DNA检测。 我们修改一下这些技术。首先，从患者细胞样本中提取DNA。提纯后，使用聚合酶链反应（ PCR增加检测DNA。为什么增加检测DNA？检测样本只含有少量细胞，例如面颊细胞，羊水细胞或脐带细胞。 这些细胞只产生少量DNA。我们需要大量DNA进行分析，所以 PCR用于生成额外的 DNA。当然，PCR产生 的DNA也完全是检测DNA。增加的检测DNA随后被限制性内切酶消化。说明消化DNA的原因。整个DNA分子过长以至于无法一次性成功检测。因此，利用限制性核酸内切酶消化检 测 DNA。限制性内

22、切酶片段随后利用凝胶电泳分离。解释凝胶电泳能够分离 DNA限制性内切酶片段的原因。由于DNA有负极，在电场内DNA片段会移动到正极。这些DNA片段穿过凝胶移动到小孔隙 内。穿过这些孔隙时，小 DNA片段的移动速度比大片段的移动速度快。因此， DNA片段被 分开，越小的片段越靠近正极，在凝胶内形成不同的片段带。分离后，使用色慎转移技术将限制性内切酶片段带转移到尼龙膜内。解释下这种转移的好处。由于电泳中使用的凝胶很容易碎，当我们处理时，很容易损坏。把DNA带转移到尼龙膜上我们可以更牢固地记录这些限制性内切酶片段。在最终准备阶段，处理尼龙膜上的DNA片段，切断连接 DNA之间的氢键。描述切断氢键处理

23、后尼龙膜上限制性内切酶的结构。互补碱基对之间的氢键把一个DNA分子中的两个多核苷酸连接在一起。当碱基断裂时，尼龙膜上包含的 DNA单链片段带。这些片段能够使拥有互补碱基序列的核酸退火后能与任何 核酸链相结合。人们已经知道有害基因碱基序列的一部分。因此，我们能够生产出具有互补序列的单链DNA探针。这些探针可以与尼龙膜上任何互补的DNA片段相结合。这个过程被称为DNA杂交。如果对DNA探针进行标记，那么就可以知道探针所在的位置。图6显示如果在检测 DNA中使用探针，DNA探针如何吸附互补碱基对序列，以及在限制性内切酶片段电泳后如何找到 标记的杂交DNA。标记物MarkerDNA 探针 DNA pr

24、obe检测 DNA test DNA探针未与检测 DNA 结合 Probe does not blind to test DNA琼脂糖凝胶Agarose gel未标记的 DNA 片段 no labelled DNA fragments氢键 hydrogen bonds检测 DNA test DNA探针与检测 DNA 结合 Probe blinds to test DNA标记的 DNA 片段 labelled DNA fragments图6制作拥有有害等位基因互补碱基序列的标记DNA探针，但正常等位基因不使用这些基因。一旦DNA探针与有害等位基因片段吸附在一起，我们就能够在限制性内切酶片段中找

25、到有害等位基因。使用图6解释生物学家如何通过DNA杂交确定采集的 DNA样本中基因的有害等位基因的位置，例如羊水细胞。由于限制性内切酶片段是从样本细胞的整个DNA上制作的，其中某一片段将含有所有和部分有问题的基因，例如3 -球蛋白基因。已经知道在有害等位基因中碱基序列不同。标记的DNA探针具有与部分有害等位基因互补碱基序列。如果没有标记附着到片段带上，则DNA不含有基因的有害等位基因。链终止法测序如何发现未知基因的碱基序列How chain termination sequencing finds thebase sequence of an unknown geneDNA杂交只能帮助我们寻找

26、已经知道的基因的碱基序列部分。DNA测序可以找到那些我们此前未研究过的基因的碱基序列。这种方法仅用于双脱氧核糖核苷酸。见图7,图中显示的是你认识的分子。分子a）是核糖，是在每一个RNA核苷酸中找到的含有 5个碳原子的糖类。 分子b）是脱氧核糖，是在每一个DNA核苷酸中找到的含有 5个碳原子的糖类。注意由于脱氧核糖比核糖少一个氧原子，因此命名为脱氧核糖 deoxyribose（215页）。现在看下分子c）。你能看出这个分子与核糖和脱氧核糖的区别吗？这个分子比脱氧核糖少一个氧原子，比核糖少两个氧原子：这就是双脱氧核糖dideoxyribose。正如核糖和脱氧核糖，一分子双脱氧核糖能够与磷酸盐和有机

27、碱结合形成一分子核苷酸。在DNA复制过程中，一个核苷酸含有双脱氧核糖（一个双脱氧核糖核苷酸）能够与模板链上的脱氧核糖核苷酸配对。不过，当DNA聚合酶遇到DNA链上的核苷酸含有双脱氧核糖核苷酸时能够停止DNA的复制。这是DNA测序链终止法技术的基础。厲OHCHiOH 亠OHCHiOH 卅OH| 1/M C1 (111HM1_1/| i I H|1 1/1H 匚H1丨HHa) rlbcncb) MHZ戸巾84c) dMecixyrMtam图7分子a）核糖，b）脱氧核糖，c）双脱氧核糖Yw z R M自动化 DNA 测序 Automated DNA sequencing图8 a）显示我们要测序的 D

28、NA单链变体。将 DNA克隆到一个载体中，这种技术通常用于噬 菌体DNA被称为M13。短寡核苷酸作为 DNA退火的引物。在重组DNA中加入DNA聚合酶，与含有以下四种碱基中的一种双脱氧核糖核苷酸的混合物： 腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。正常情况下，DNA聚合酶附着在引物上并开始复制重组DNA的过程。新链开始生长，从链的起始端开始自由核苷酸形成互补碱基氢键（图8b）。MW-41&亦*PYldtauHid 卯门lift*a）引物 primer 单链 DNA single-stranded DNA 载体 vectorb）DNA 合成酶 DNA polymerase 产生 DNA 链 develo

29、ping DNA strandc）关键点key双脱氧核糖核苷酸 ddNAd）利用双脱氧核糖核苷酸分离终止的DNA片段 separated DNA fragments terminated withddNA电泳中使用的毛细管 capillary tube used in electrophoresis图8使用自动化DNA测序器的原则。a）将要测序的单链 DNA的长度被克隆到载体中并加入 引物。b）DNA聚合酶附着引物并开始DNA复制，通过重组基因碱基的互补碱基增加核苷酸。c）DNA聚合酶插入一个双脱氧核糖核苷酸DNA链复制终止。d）如果正常（脱氧核糖核苷酸）与双脱氧核糖核苷酸的比值足够高的话，那

30、么可以产生含有100-700个核苷酸的多条链。不过，部分双脱氧核糖核苷酸也出现在核苷酸的混合物中。偶然情况下，当DNA聚合酶插入了其中一个核苷酸而未插入双脱氧核糖核苷酸，那么DNA复制也会停止。如果脱氧核糖核苷酸与双脱氧核糖核苷酸的比值足够高，我们可以终止DNA链的互补，DNA链的长度不同，从一个核苷酸到数百个核苷酸。图8c）显示使用四种类型双脱氧核糖核苷酸（ddNA ）中的一种如何停止 DNA的复制。当ddNA与重组DNA链上的胸腺嘧啶形成互补碱基对时，复 制停止。每一种类型的双脱氧核糖核苷酸利用不同的荧光染料标记。携带腺嘌呤的双脱氧核糖核苷酸（ddNA）采用绿色染料标记，ddNC采用蓝色染

31、料标记，ddDG采用黄色染料标记而 ddNT 采用红色染料标记。在孵化期结束的时候，新形成的DNA片段从模板DNA上分离出来，利用特殊类型的电泳把毛细管（图8d）内的这些新单链按大小分离开。这项技术的分离度很高可以分离出不同长 度的DNA链中的单个核苷酸。当用激光束照射时，四种双脱氧核糖核苷酸中的每一种双脱氧核糖核苷酸均会发出荧光。荧光剂的颜色和位置可以利用检测器读出，随后检测器会把信息输入到计算机中，或存储数据用于后续研究，或将信息打印出来，如图9中的打印件。自动化测序器可以在两个小时内读 出大约100个不同的DNA序列。电泳中使用的毛细管 capillary tube used in el

32、ectrophoresis激光laser检测器detector计算机 computer打印printout 标记 DNA 片段的移动 Movement of labelled DNA fragments图9随着复制的DNA片段的分离，这些片段穿过激光和荧光。荧光检测器读取荧光信 息并把数据发给计算机用于分析。彩色的打印件可以显示DNA样本中的碱基序列。解释人工 DNA 测序的结果 Interpreting the results of manual DNA sequencing手工方法和上述自动化测试方法相似，除了以下方面：单独分离每一种类型的双脱氧核糖核苷酸一ddNA、ddNC、ddNG和d

33、dNT在孵化后，四个化合物将被放置在凝胶分离孔中，通过凝胶电泳分离 双脱氧核糖核苷酸采用放射性物质标记，而不采用荧光染色标记 制作凝胶的萨瑟恩转移，并制作放射自显影图。读取DNA的序列相对容易。图10显示的是部分放射性自显影图。对于每一个双脱氧核糖核苷酸碱基，可以看出DNA复制终止的地方出现 DNA片段带。如你所知，越小的片段移动形成的片段带越远。这将是DNA片段复制停止的第一个碱基。电泳方向 direct ion of electrophoresis含有反应混合物样本的孔与含有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶的双脱氧核糖核酸发生孵化反应 Well containing sample of r

34、eaction mixture incubated with dideoxynucleotides containing ade nine, cytos ine, gua nine or thy mine放射自显影法底部 bottom of autoradiography图10该自显影图顶部为含有反应混合物样本的孔分别与含有腺嘌呤（ddNA）、胞嘧啶（ddNC）、鸟嘌呤（ddNG）或胸腺嘧啶（ddNT）的双脱氧核糖核酸发生孵化反应。下面每个孔内是分离的DNA片段的轨迹，DNA复制过程中出现双脱氧核糖核苷酸形成了DNA片段。新合成的 DNA序列可以通过确认每个片段移动的距离来读取，从移动最远的片

35、段开始确认。看图10哪些DNA片段带移动的最远？移动的最远的是 ddNA踪迹中的片段。这是双脱氧核糖核酸停止DNA合成酶形成DNA新链时产生的最小片段。DNA片段能形成的最小片段是什么？最小的片段是一个核苷酸。偶然情况，双脱氧核糖核苷酸第一个被插入到新 DNA链中， 从而停止DNA合成酶插入更多的核苷酸。 我们现在发现了包含在新 DNA链内的第一个 核苷酸，携带腺嘌呤。读出放射自显影图，DNA倒数第二小的片段携带什么碱基？倒数第二小的片段是在ddNC的轨迹中。这个 DNA片段仅有两个核苷酸的长度，携带胞嘧啶。检测基因的前两个碱基是腺嘌呤和胞嘧啶。DNA序列的第三个碱基是什么？移动距离第三远的片

36、段是在 ddNG轨迹中。这个片段由于携带了 ddG核苷酸，因此能够 停止DNA的复制。因此我们得到的第三个碱基是鸟嘌呤， 测试基因的碱基序列为 ACG 继续读出图10中的放射自显影图。什么是 DNA的DNA序列？通过重复我们刚刚所做的工作，你可以发现碱基序列为ACGCATGTTCDNA 指纹图谱 DNA fingerprints你已经知道我们的染色体所携带的基因都是按相同的顺序排列的相同基因。因此，你可能认为，如果我们用限制性核酸内切酶来消化来自不同两个人的同一位置染色体的副本会得到同 样序列的限制性内切酶片段。事实是，我们不会得到这样的结果，我们会得到不同序列的限制性内切酶片段。出现这种情况

37、是因为， 在NDA的非转录区，每个人都有不同的碱基序列， 碱基序列重复出现。这些重复出现的碱基序列包括限制性内切酶片段长度多态性（RFLPs发音为fiffleps），和短串连重复序列（STRs）因为这些重复的碱基序列长度因人而异，我们可以 利用这一现象来识别组织样本中DNA的来源。这是 DNA指纹图谱 的基础。图11显示，不同长度重复碱基序列上的成分如何对取自两个DNA样本的限制性核酸内切酶上的识别点间距离产生影响。由此，被限制性核酸内切酶消化的两个DNA分子会产生不同长度的DNA片段。图12显示，这些不同长度的 DNA经电泳后如何产生不同的限制酶片段。 重要一点是，只有同卵双胞胎拥有相同的非

38、转录区，重复的碱基序列，也只有他们才会产生相同的限制性内切酶片段。i1It* n t1匚啊盘nlrrnriHZEErn厂 iri、jFarHnip-dl rrpi?-dia重复序歹U repeat sequeneeDNA 链 DNA strand额外的重复序歹U additi onal repeat seque nces图11每一条带表示从两个不同的人 A和B取出的相同碱基位置的 DNA分子的一部分。限 制性核酸内切酶的识别位置显示在图中的每一个DNA分子上。由于DNA的非编码区域含有更多的重复碱基序列，因此 B中的识别位置距离更远。利用标记探针通过 RFLPs的杂交进行 DNA指纹图谱 fi

39、ngerprinting by hybridisation of RFLPs with labelled probes这种方式是基因指纹图谱的传统方法。在本章前面部分你已经了解了这些技术。利用限制性核酸内切酶，DNA的样本被限制性内切酶片段消化。由于片段内重复碱基序列的数目不同，限制性内切酶片段的长度不同，因此每一个个体都是独一无二的。随后利用凝胶电泳分离这些片段，根据片段获得萨瑟恩印迹。A 列 lane A B 列 lane B 放射自显影图 autoradiograph图12如图11中显示的两组 DNA被相同的限制性核酸内切酶消化后产生的带状图形。由于 B的DNA含有的重复碱基序列比 A多

40、，因此B列中的DNA片段比A列中的DNA片段长。 带有互补碱基序列的放射性标记探针对于重复序列来说是添加的印迹。在探针与含有重复序列的限制性内切酶片段杂交的地方会显示出标记带。因此指纹图谱中的每一条DNA片段带均代表包含重复序列的 DNA片段。图12显示出两个人的基因指纹图谱。由于两组DNA中重复序列的位置不同，因此 DNA片段带的类型不同。利用前面说的RFLP这项经典的DNA指纹图谱技术已经得出碱基序列为GGGCAGGABG其中B代表任何碱基。RFLP使用的是DNA样本中非编码区重复的不同次数。图13显示RFLP分析的结果，在美国 RFLP分析导致一名罪犯被判处死刑。一对年轻的夫妇 当他们在

41、车内睡觉时被谋杀了。他们的尸体在第二天被发现。 验尸检查显示他们均死于枪伤而且这名妇女已经被强奸了。没多久一名驾驶着这对夫妇被盗的汽车的男人被捕。在警察问询后，他确认在谋杀案发生的当天晚上他和一个朋友在一起。从妇女身体内取出的精子 DNA以及两名嫌疑犯的 DNA样本使用相同限制性核酸内切酶消化，并使用凝胶电泳分离限制性 内切酶片段。如果你看下图 13,你会看到精子的 DNA指纹图谱类型和嫌疑犯 1的限制性内 切酶片段并不相同，但与嫌疑犯2的类型完全相同。基于这一证据，嫌疑犯2被定罪为强奸 谋杀罪，被判处双死刑。同时，陪审团告知普通人中限制性内切酶片段类型相同的几率是九 十亿分之一。这项实验进行

42、时，世界人口数不到60亿。嫌疑犯1 Suspect 1精子样本 semen sample嫌疑犯2 suspect 2图13首次利用RFLP分析的结果判处一名罪犯死刑。嫌疑犯2的DNA指纹图谱和从被谋杀的妇女体内取出的精子的DNA指纹图谱显示嫌疑犯 2是强奸犯。他被定为强奸罪和谋杀罪，被判处双死刑。贝恩斯的一家 The Bains family贝恩斯先生于1990年首次定居英国。两年后，他申请让其妻子和四个孩子和他共同居住。移民局需要确认这些孩子有权到英国居住，所以他们对整个家庭进行了RFLP分析。图14显示RFLP分析结果。贝恩斯先生此前结过婚。不幸的是他的第一任妻子儿子出生时去世了。几年后，

43、贝恩斯先生再婚，他和新妻子生育了两个女儿。他们还收养了另外一个儿子。1、看图14中的第1列和第2列。结果显示的是贝恩斯先生和太太分离的限制性内切酶片段。 解释为什么两个限制性内切酶片段的类型不同。2、 图14中的第6列显示贝恩斯先生和太大收养的儿子的限制性内切酶片段。解释这项结论 有效的原因。第一列贝恩斯太太 lane 1 Mrs Bai ns第二列贝恩斯先生 lane 2 Mr Bai ns第三列lane 3第四列lane 4第五列lane 5第六列lane 6图14贝恩斯家庭成员 DNA指纹图谱利用短串连重复序列(STRs的聚合酶链反应(PCR进行DNA分型DNA profiling by

44、 PCR ofshort tandem repeats (STRs)此前描述的传统 DNA指纹图谱方法有一些限制。例如：要求有很大量的DNA样本，所以从头发或血迹中找到的DNA数量经常不够这项技术使用的解释这些DNA片段带的问题导致 DNA指纹图谱不足以成为法庭定罪的确凿证据。结果，更加强大的技术替代了传统指纹图谱技术。涉及DNA分型。除了 FRLPs我们DNA非编码区还存在短串连重复序列 (STRS,也被称为微卫星。STRs是 碱基序列重复区，比 RFLPS短很多。在我们自己的基因组内，最常见的短串连重复序列是胞 嘧啶和腺嘌呤两个碱基的重复序列，重复的次数在5-20次之间，例如 CACACA

45、CACACACA在任何一个短串连重复序列中重复的次数均不相同；在一个种群内，一个短串连重复序列至多可能有10种不同版本。DNA分型需确定选择 STR数量的不同版本。利用针对每一边特殊重复序列的DNA退火的引物，PCR可用于制作包含这些 STRs的多个副本。在利用PCR扩大DNA片段后，使用凝胶电泳分离DNA片段。问题6使用这里以及261页基因指纹图谱的资料说出限制性内切酶片段长度多态性(RFLP和短串连重复序列(STR的一点区别。图15显示的是DNA分型后的凝胶。第2列和第3列显示两个不同的人的相同STR分型结果。针对这个STR每个人均有两个不同的 DNA片段带，表示从父母双方继承的基因的重复

46、序列 的区别。虽然他们有一个 DNA片段带相同，但这两个人的 DNA分型不同。正常情况下，利 用部分选定的 STRs进行DNA分型，这样凝胶中会出现更多的片段带。图15第4列显示一iJiHB 1： urui MZl Lww 1 3nt ii pI个人的三个不同的 STRs的分析。mam mnLw A Pt It &査严啤昨鼻;i誓介員Ai H第 1 列：DNA 大小标记 Lane 1: DNA size markers第2和3列：两个个体中的一个基因的一个短串联重复PCF。两个人的分型不同，但有一个片段带(等位基因)相同 Lanes 2 and 3: PCRs of a single shor

47、t tandem repeat in one gene fromtwo in dividuals. The two in dividuals have differe nt profiles but one band (allele) in com mon第4列：三个基因的短串联重复PCR(标记为 A、B和C)Lane 4: A PCR of short tan dem repeatsin three genes (labelled A, B and C)图15使用STRs进行DNA分型正如此前提到的自动化测序技术，STR片段可以使用荧光染料进行标记并使用毛细管电泳分离。扫描仪读出序列并把数据

48、输入计算机内，利用计算机进行样本材料的比较。这项技 术在标准试验中更加灵敏，现在被很多司法鉴定科学家团队使用。图16显示的是自动化扫描仪的打印类型。图16自动化DNA分型器的打印件。你可能在电影或电视节目中的犯罪现场调查中看见过 这种类型的DNA指纹图谱。道德和伦理问题 Moral and ethical issues作为生物学学生，你应该具有一些DNA技术引起的道德和伦理问题的识别能力和讨论能力。 如果本书中出现正确反应的建议那么本书就出现了错误。你们必须建立自己的理解。不过，使用适当的科学术语和理解，希望你们可以讨论基因克隆和DNA技术引起的有争议 的问题。下面三个例子可以展示你的生物学知

49、识和理解。 你可以表达对生产转基因动物对动物造成的痛苦的担心。作为生物学家， 你应该能够区分动物体内的外源基因的作用以及生产转基因动物的程序。 外源性基因通常不会给动物造成痛苦， 在生产转基因动物的操作可能会给动物带来痛苦。 例如，体细胞核转移产生的动物（ 214 页）出生缺陷的比例相当高，甚至出生健康的动 物也会出现提早衰老的问题。你可能利用多利羊作为提早衰老的例子。 如果这样的话， 你应该清楚多利羊不是转基因 动物。他的提前衰老是与体细胞核转移技术有关而与外源性基因无关。你可能会表达对使用转基因植物来提高农作物产量的担心。作为生物学家， 你不应该利用例如 转基因植物会破坏环境 这样的陈述来

50、论证对这一 问题的担心。 你应该通过具体的转基因作物造成的破坏的例子来展示你在生物学概念和 原则方面的知识和理解。 例如，你可能说抗除草剂的外源基因在细菌内的水平基因转移， 从转基因作物植株转移到杂草植株内， 可能导致杂草成为更大的害虫。 你可能回顾一下 252 页的内容，外源基因通常被插入到叶绿素内的 DNA 中，通过花粉粒减少水平转移 到其他植物内的几率。你可能表达对使用基因治疗治疗人类疾病的担心。 这些问题无法轻易回答， 但是你可以提供 一个包括生物学知识的平衡论点。例如，你可能讨论：反对在患者的肺部细胞内插入校正的基因版本并在呼吸道吸入器内使用脂质体治疗囊 性纤维化的说法不合理如果骨髓移植能够被接受， 通过在造血干细胞内插入校正的基因治疗血液障碍的方式很 难被拒绝生殖细胞治疗有利于生产出能够分泌低脂肪高蛋白牛奶的奶牛。不过， 由于这类基因操作设计会改变动物的基因型或间接改变该动物的后代的基因型， 因此人们无法接受在人 类中使用这种技术。使用上帝造物 的说法不是一个很好的思路， 因为这种说法没有包含生物学知识或对生物 学的理解。 记住一名优秀的科学家在形成论证时要使用可靠来源的证据， 而不使用未经证实 的观点。