第七章-纳豆-新版(共11页)

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1、精选优质文档-倾情为你奉上第七章 纳豆7.1 概述纳豆 (Natto) 是日本的一种传统的发酵豆制品，由纳豆菌 (Bacillus natto) 在一定温度、湿度下发酵蒸煮大豆而成，作为日本人的主要佐餐食品已有两千多年的历史，在民间一直药食兼用。成熟的纳豆色泽金黄，表面覆有一层粘性物质，挑起时有长长的拉丝状物质，如图7-1 所示。纳豆风味独特，营养丰富，具有多种保健功能，被誉为“超级健康食品”，深受日本人民的喜爱。目前，纳豆已成为盛行于日本、加拿大、美国和欧洲一些国家的一种保健食品，我国也有企业开始生产和销售。纳豆在发酵过程中，纳豆菌产生一种丝氨酸蛋白酶 (纳豆激酶Nattokinase)，该

2、酶最早于1987年由日本宫崎医科大学的须见洋行等发现。研究表明，纳豆激酶具有纤溶活性，可以治疗和预防血栓疾病。目前，关于纳豆菌的研究和应用主要集中在纳豆激酶的作用上。但是，作为保健食品的纳豆还具有多种保健功能，如溶血栓、抗肿瘤、降血压、抗菌等作用，可预防骨质疏松、提高蛋白质的消化率、抗氧化等。图7-1 纳豆的形态7.2 纳豆菌传统制作纳豆的方法是采用稻草作为发酵菌剂的来源，将煮熟的黄豆冷却后用稻草包裹后于温、湿度比较高的地方自然发酵12 d，待到黄豆表面出现一种白色的黏液状物质即可。目前在日本，纳豆食品生产基本实现了工业化、连续化和商品化。Sawamura是第一个将纳豆中筛选出的杆菌命名纳豆杆

3、菌的研究学者，Muto后来研究发现纳豆杆菌属于枯草芽孢杆菌属，为需氧型革兰氏阳性菌。自从1934年北海道大学农学部半询教授首次成功地将分离的纯种纳豆菌（Bacillus natto No.1）使用于纳豆的工业化生产后，至今已知与纳豆生产相关的主要纯菌种有：BacillussubtilsIFO3007、BacillusnattoSawamura06、Bacillus natto Sawamura IFO 3339等。枯草芽孢属的重要特点是能够分泌各种胞外酶，包括蛋白酶、淀粉酶、谷氨酸转肽酶（GTP）、脂肪酶、果聚糖蔗糖酶和植酸酶，纳豆菌分泌的酶比其它枯草芽孢杆菌分泌同样活性的酶高几十倍。纳豆菌带

4、有芽孢，因而能耐盐和耐碱、耐高温（100）及耐挤压，在酸性胃环境中均能保持高度的稳定性，在肠胃道中不增殖，只在肠道上段迅速发育转变成具有新陈代谢作用的营养型细胞。纳豆菌对营养要求不高，可以在人体肠道中定殖，对人体肠道中微生态的平衡具有很重要的作用。图7-2 为纳豆菌的生物学的形态。图7-2 纳豆菌的生物学形态7.2.1 纳豆菌的主要保健作用纳豆是大豆煮熟后经接菌发酵而制成的功能食品，它除了保持原料大豆的营养外， 有些成分的含量比煮熟的大豆还要高，如蛋白质、纤维、钙、铁、钾、维生素B2、维生素B12等,特别是纤维、钙、铁、钾的含量甚至超过了鸡蛋。由于纳豆发酵过程中产生多种酶类，如淀粉酶、蛋白酶、

5、脂肪酶、纤维酶、溶菌酶和-谷氨酸转肽酶等，酶的作用使蛋白质及其它营养物质发生分解，因此，纳豆的消化率（85）比煮熟大豆（68）的高，营养更容易被吸收。同时，纳豆在发酵过程中还产生或增加许多对人体有益的活性物质，如纳豆激酶、异黄酮、超氧化物歧化酶（SOD）、皂甙素、生育酚、吡啶二羧酸、VK2等，纳豆的营养与活性物质使纳豆在食用中体现了多种医疗保健功能。 1溶解血栓 须见洋行研究发现，纳豆及纳豆的生理盐水浸提物能够直接溶解纤维蛋白，是一种具有溶栓活性的酶制剂。该酶能强烈溶解血栓，定名为纳豆激酶(natto kinase)。它由275个氨基酸残基组成，不含二硫键，分子量依测定方法不同在2730035

6、000 道尔顿不等，根据氨基酸序列计算准确的分子量为27728，无毒、无副作用，是一种中性丝氨酸蛋白酶。随后，须见洋行又将纳豆激酶用于健康人群的体内研究，证明它除有显著溶栓作用外，还有促进静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂能力，从而间接表现其溶栓活性。经实验表明，每日食用纳豆可以起到预防血栓类疾病的作用，特别是在晚饭时食用效果较佳。其原因是血栓类疾病如心肌梗死等往往是在上午发作，纳豆激酶在进入人体28 h内血栓溶解的速率比较高，所以晚饭时食用有助于预防次日上午心肌梗死的发作。据报道，有心肌梗死危险的患者，一次需投入尿激酶30万单位，而50 g纳豆中含有80万单位尿激酶溶解血栓的作用。纳豆激酶除具有

7、直接的溶栓作用外，还能将纤维蛋白溶酶原、尿激酶原激活，从而表现出间接的溶栓效果。由于此酶作用时间长，因此有利于临床应用。2抗肿瘤 纳豆还具有防治癌症的功效。许多研究证实，大豆作为纳豆的原料含有多种抗癌物质，除酚类和黄酮类之外，还富含膳食纤维以及硒，可预防乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肾癌、尿道癌、大肠癌等。纳豆除含有多种抗癌成分外，纳豆菌本身也可有效地破坏或杀死癌细胞，刺激免疫系统诱发产生干扰素，起到抑制癌症的功效。1967年，金泽大学药学院的龟田报告了纳豆抗癌动物实验的结果，他将Ehrlich肉瘤移植到鼠的左右足皮下，23 h后，在右足部注入纳豆菌，11天后观察，右足没有癌细胞生成，而左足有癌细

8、胞生长。证实纳豆菌能抑制癌细胞生长。龟田教授将有这种抗癌效果的纳豆命名为KMD1126，但具体的抗癌活性物质是什么当时并不清楚。1995年高桥等通过体外细胞培养实验，揭示了纳豆中含有的抗癌活性物质是一种含3032个碳的直链饱和烃，其中三十一碳烃在纳豆中含量最多，活性也最高。目前研究证实，纳豆中含有的5，7，4 三羟异黄酮(genistein)，是纳豆中起抗癌作用的主要物质，其含量是豆腐和豆奶中的5倍。此外，纳豆中还含有胰蛋白酶抑制剂，其抗癌功效已在动物实验中得到证实。纳豆中含有染料木素（Genistein）和染料木苷（Genistin），类似枯草溶血素的脂肽，还含有丰富的植物雌激素和一种叫In

9、brafin的类黄酮色素形成成分，这些物质有强烈的裂解功能，可抑制肿瘤细胞的增殖。3降血压 日本前帝国大学林右市等对纳豆预防高血压的效果进行了实验。研究表明，纳豆中含有降血压作用的血管紧张素转化酶抑制剂，这种物质存在于纳豆中，但以纳豆表面的黏稠物质中含量更多。此抑制剂分水溶性和醇溶性两种，其中水溶性抑制剂为高分子质量的蛋白质，IC50为12 mg/mL；醇溶性抑制剂为低分子质量物质，具有两种形态，抑制作用强于水溶性抑制剂，IC50分别为0.53 mg/mL和0.95 mg/mL，pH和温度稳定性好。这两种形态的醇溶性抑制剂的抑制模型是不同的，一种是竞争性抑制，一种为非竞争性抑制。这种血管紧张肽

10、转化酶抑制剂在不同的pH和温度范围内均保持很好的稳定性。因而，纳豆具有预防和治疗高血压的作用。在动物实验中，使有遗传性高血压的老鼠每天摄入纳豆，与摄入等量大豆的老鼠作为对照，结果食用纳豆的鼠血压波动低于对照组。4抗氧化性、延缓衰老 从纳豆和未经发酵的大豆的对比实验可见，纳豆显示了比未经发酵的大豆制品高得多的抗氧化性，它可抑制脂肪氧化达91，而后者只能抑制13，这可能与纳豆中含有的抗氧化物质，如异黄酮和-生育酚(维生素E)有关。经常食用纳豆可有效降低血脂、胆固醇及清除脑组织细胞中过氧化脂质色素，调节皮肤细胞表水和脂肪平衡，促进血液循环，改善皮肤弹性，使皮肤光洁柔软，达到延缓衰老的功效。纳豆中含有

11、大量的抗氧化物质，如卵磷脂、异黄酮(isoflavones)、-生育酚（维生素E）、超氧化物歧化酶，还含有大量的皂甙素。另外，纳豆对由过氧化物所引起的细胞伤害也有疗效。最新报道，纳豆中水溶性低分子质量粘性物质可防止动脉硬化，降低脂类过氧化反应，加强脂类代谢。5防治骨质疏松 纳豆中维生素K分为维生素K1 和维生素K2 两种，其中维生素K1 包含在纳豆内，不溶于水；维生素K2 存在于纳豆外面的黏性物质中，溶于水，100 g纳豆中约含1000 g维生素K2 。维生素K2 可促进生成骨蛋白质（Osteocalcin），这种蛋白质可与钙共同生成骨质，增加骨的密度，从而防治骨质疏松症。在日本调查发现，消费

12、纳豆较多的地区，骨折发生率显著降低。食用纳豆的东京女性血液中维生素K2的含量比不食用纳豆的伦敦女性高15倍。须见洋行等实验证实，进食100 g纳豆，4 h后血液中维生素K2的浓度最高可达原来的54倍。1995年，东京大学医学部曾对6000例60岁以上的骨质疏松患者进行了调查研究，结果表明，服用维生素K2不仅可以减缓腰痛，而且骨骼的重量也增加了。易患骨折人的血液中的维生素K2的浓度仅是健康人的50左右，常吃纳豆可以预防和治疗骨质疏松症。每天食用10 g纳豆就可为机体提供足够的维生素K2。 6抗菌消炎 早在第二次世界大战期间，纳豆菌对于霍乱、伤寒菌和赤痢菌的抗菌效果就有过报道。研究表明，纳豆菌可产

13、生多种抗菌物质，如杆菌肽、多黏菌素、2,6-吡啶二羧酸，对细菌、酵母和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙门菌、伤寒菌、痢疾菌及O-157、H7大肠杆菌等致病菌的作用，还可灭活葡萄球菌肠毒素。在抗生素使用前，日本民间长期用纳豆治疗痢疾、伤寒等消化道疾病，常食纳豆可起到壮体防病作用。通过接种纳豆菌的动物实验发现，纳豆可以提高机体的抵抗力，还可以诱发机体干扰素的生成，增强机体的免疫力。纳豆也正由于具有这些抗菌物质，才会在充分发酵后不易腐烂。 7提高蛋白质消化率 纳豆菌不产生毒素，是人体无病原性的安全菌球。它能分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶和脲酶等多种酶类。这些生物酶作为消化酶能够有效地发挥作

14、用，有助于消化吸收，使纳豆不仅保持了大豆几乎不含胆固醇及脂肪酶含量高，营养均衡的优点，且大大提高大豆的消化率，使大豆蛋白质消化率由原来的50提高到85以上。这是由于有5060的大豆蛋白质转化为肽和氨基酸，其中10是氨基酸。8调整肠功能 大豆中约有10碳水化合物，其中2/3是半纤维、纤维素和木质素等食物纤维，可防止便秘，预防大肠癌和直肠癌，还有降脂减肥等功效。食用纳豆后，纳豆菌在肠中发芽增殖，作为营养物质能在肠内生活几周，分泌各种酶和维生素，促进小肠黏膜细胞的增殖。同时，纳豆中的纤维素类物质可以与寡糖偶合，从而促进双岐杆菌等益生菌的增殖，抑制致病菌的繁殖，对肠道菌群的微生态平衡起重要作用，保证肠

15、功能的正常。9降低胆固醇 纳豆脂质中亚油酸占全脂质的50，有报道亚油酸能降低血浆中的胆固醇含量，有预防动脉硬化、心脏病和高血压的功效，故纳豆具有降低胆固醇的作用。10其它功能 纳豆中因含有多种维生素、卵磷脂、麻酸等，因此具有抗衰老、提高记忆力、防止酒醉、美容等保健功能。纳豆中含有大量的黏性物质，其主要成分是高聚谷氨酸，因其具有强烈的保湿性能和增稠等效果，被广泛应用于食品行业和农业中。纳豆菌产生的吡啶二羟酸结合金属的能力很强，能够清除体内的放射性元素，常吃纳豆可减少患白血病的几率。纳豆在发酵过程中产生的菌丝黏液物质，其成分为类果聚糖的混合物；果糖和-多聚谷氨酸，它被覆在黏膜的表层上，可保护肠胃，

16、防止醉酒。有些研究还认为，大豆制品中的某些蛋白质可促进甲状腺激素分泌，从而促进糖和脂肪的分解代谢，提高和保持精力。7.2.2 纳豆产品的开发纳豆作为一种功能性食品在日本方兴未艾。据日本纳豆学会统计，日本有2048家工厂生产纳豆以供应市场需要。在韩国，纳豆也受到欢迎；在我国香港也有纳豆上市，并得到许多人的喜爱；在美国，一种与纳豆相类似的印尼豆食品日益成为美国人欢迎的健康食品。在我国，越来越多的人开始注重生活质量，饮食营养与身体健康成为当前人们的追求。据中国疾病控制中心的调查指出，今后的一段时间我国将处于老龄化高峰期，血栓疾病将呈现上升趋势。对此，作为营养丰富的保健食品，纳豆必将成为人们的热衷食物

17、，其市场需求将会十分庞大。近年来，随着一些科研单位和企业研制成功纳豆食品，并投放到市场上后，已得到一些人的认可。如燕京啤酒集团引进日本先进的技术推出一系列纳豆保健食品，成为目前国内生产纳豆的知名企业。投资设立的北京燕京中发生物技术有限公司，进行年产1000吨纳豆和30吨纳豆素胶囊的研究和生产。天津市百德生物工程有限公司投入近千万元，与中国农业大学等科研院所合作，经过多年的科研开发，采用独特发酵工艺及有机大豆自行培育出优良纳豆菌种, 该公司生产出的纳豆咀嚼片已投入市场，得到一些消费者的喜爱。 纳豆有一种特殊的味道,对于无法接受日本传统纳豆风味,又希望获得纳豆功能性的消费者，企业开发出了另一种形态

18、的纳豆保健食品，将纳豆的功能性成分提取出，并调制成不同风味，生产功能性纳豆保健品。目前，一些科研单位和企业在纳豆保健功能开发上更多的是研究纳豆激酶，通过液体发酵方法生产纳豆激酶；或者提取发酵纳豆的粘液成分做成纳豆口服溶栓药物和保健食品。如上海康年生物科技有限公司、河南洛阳华以生物工程有限公司、北京纳百恩食品有限公司等都是与日本的研究机构和企业合作开发出了纳豆激酶系列产品，实现了工业化生产。食用纳豆已有千年的历史，但纳豆的许多功能并没有完全开发出来，特别是作为天然防腐剂的工业化产品还没有，还须更多的科研单位和企业加入深入研究纳豆的功能，将纳豆及其延伸物的市场做大、做强。7.2.3 纳豆菌产生抗菌

19、物质的种类纳豆菌可产生许多抗菌素，如杆菌肽，多粘菌素和2，6吡啶二羧酸，这些物质对痢疾杆菌、原发性大肠杆菌O-157、O-111、O-144、伤寒菌、沙门氏菌等，都有强烈的抑制作用，因此,纳豆菌具有强烈的抗菌活性。有研究者通过混合培养试验，确认了纳豆菌和纳豆成分对于病原性大肠杆菌O-157具有很强的抑制生长繁殖的效果，同时认为2，6-吡啶羧酸是具有耐热性的物质。在过去的几十年内，已经发现700多种肽类抗生素。这些肽类物质被分为两类，一类是非核糖体合成的肽类抗生素，另一类是由核糖体合成的天然肽类抗生素。杆菌肽和多粘菌素属于非核糖体合成的肽类抗生素。非核糖体合成的肽类抗生素是由细菌、真菌和链霉菌等

20、分泌的具有抗菌活性的肽类物质。纳豆菌分泌的具有抗菌活性的代谢产物为杆菌肽和多粘菌素。7.2.4 纳豆菌产生抗菌物质的生理活性和抗菌机理7.2.4.1 抗菌物质的生理活性纳豆菌生产的多粘菌素、杆菌肽和2，6-吡啶羧酸，它们有各自的抗菌活性和抗菌机理。多粘菌素包括多粘菌素B（polymyxin B）及多粘菌素E（polymyxin E；粘菌素，colistin），它们是多肽类抗生素，二者具有相似的药理作用。对多数革兰氏阴性杆菌有杀灭作用。多粘菌素E 的抗菌谱与多粘菌素B 相仿，但抗菌活性较比多粘菌素B 略差。多粘菌素的主要敏感菌有大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、弧菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌等，

21、尤其对绿脓杆菌具有强大的杀菌作用。杆菌肽主要作用于革兰氏阳性菌。杆菌肽对耐药的金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌有效，对螺旋体和放线菌也有效，但对革兰氏阴性菌无效。2,6-吡啶二羧酸在1936年由日本学者最早发现纳豆菌的芽孢中存在着2，6- 吡啶羧酸（纳豆粘液中）。它是由于纳豆菌发酵大豆才生成的，有一定的抗菌作用，且热稳定性好。7.2.4.2 抗菌机理多肽类抗生素具有表面活性，含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌细胞膜的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，使细菌细胞膜面积扩大，通透性增加，细胞内的磷酸盐、核苷酸等成份外漏，导致细菌死亡。多粘菌素是通过破坏细菌胞膜，改变细菌细胞膜的通透性而起到杀菌作用的

22、。杆菌肽是通过抑制革兰氏阳性菌胞浆内的肽聚糖前体转变为焦磷酸萜醇，从而起到抑菌作用的。2，6- 吡啶羧酸对各类细菌广泛具有抗菌作用的特性已经得到了证明，但其抗菌作用机理还未完全弄清，目前国内外均没有报道。7.3 纳豆菌的培养和抗菌性试验7.3.1 纳豆菌的培养和抗菌粗提液的制备7.3.1.1 纳豆菌的培养菌种为日本高桥祐藏研究所保藏的高桥纳豆菌(Bacillus natto.Takahashi)；培养基为：蛋白胨1.5 g/100mL%，葡萄糖1.5 g/100mL，KH2PO40.2 g/100mL，K2HPO40.4 g/100mL，MgSO4 0.05 g/100mL，pH7.07.4。

23、从斜面上挑取几环菌种接入装有70 mL液体培养基的三角瓶中，于37、100 r/min摇床振荡培养1624 h得种子菌悬液。将种子菌悬液以3%的接种量接种于发酵培养基中，以同上的条件培养。定期取样测定pH、OD600及抑菌活性，结果如图7-3所示。图7-3 纳豆菌的发酵曲线从图中可知，纳豆菌生成迅速，发酵24 h后进入稳定期；整个发酵过程中pH值缓慢下降，最后稳定在pH6.0。从抗菌活性看，培养6 h时，未发现抗菌活性，至12 h时有较强抗菌作用，在进入稳定期后抗菌活性最大，48 h后抗菌活性缓慢下降。7.3.1.2 纳豆菌抗菌粗提液的制备1发酵液中提取抗菌物质 发酵液4下3500 r/min

24、 离心15 min去菌体,得到去细胞液, 6 mol/L的HCl调pH至2.0, 4 静置过夜；次日, 4、10000 r/min离心15 min收集沉淀,用20 mL甲醇将其溶解, 1 mol/L NaOH调pH到7.0，即得粗提液,用滤纸片法检测其抑菌效果。2发酵纳豆中提取抗菌物质 称取新鲜纳豆60 g, 加适量蒸馏水充分研磨, 纱布过滤。残渣中加水再浸提两次, 滤液合并后浓缩至60 mL。该液于121高压灭菌18分钟, 放入4冰箱保存备用。用滤纸片法检测其抗菌效果。3指示菌悬液的制备 从斜面上分别挑取少量菌接种于液体培养基中，37培养1824 h。酵母菌悬液和霉菌孢子悬液均以生理盐水配制

25、。7.3.2 抗菌实验7.3.2.1 纳豆菌的抗菌试验取106107 CFU/mL 的指示菌0.1 mL涂平板。分别将样品点样于滤纸片上（直径5.5 mm的双层滤纸，点样10 L），待晾干后放于已涂布指示圈的平板上，细菌37培养24 h、酵母菌30培养48 h、霉菌28培养48 h后测抑菌圈直径。表7-1 纳豆菌的抗菌作用微生物纳豆菌发酵提取液抑菌圈直径 (mm)纳豆提取液抑菌圈直径 (mm)志贺氏菌26.023.5大肠杆菌11.013.5沙门氏菌9.07.5普通变形杆菌7.08.0金黄色葡萄球菌20.018.5金黄色微球菌13.011.5巨大芽胞杆菌8.57.0李氏特菌9.58.0枯草芽胞杆

26、菌-蜡状芽胞杆菌-异常汉逊酵母20.021.0啤酒酵母15.512.5产朊假丝酵母16.517.5拮青霉9.510.5尖镰孢9.08.5扩展青霉9.59.0镰刀霉8.58.0黑根霉8.04.0黄曲霉7.02.0表7-1为抑菌试验结果，可以看出，纳豆菌具有广谱的抗菌作用，发酵生产纳豆菌提取液和纳豆提取液均对格兰氏阳性菌、格兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌均有一定的拮抗作用，特别是对志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和异常汉逊酵母具有较强的抑菌作用。纳豆菌提取液的抑菌较纳豆提取液的抑菌作用强，这说明其含有较多质量的抑菌成分。图7-4为纳豆菌抑制大肠杆菌的抑菌效果图，从图中能明显看到光亮的抑菌圈。图7-4 纳豆菌的抑

27、菌(大肠杆菌)效果图7.3.2.2 纳豆菌抗菌物质的酸碱稳定性将纳豆菌抗菌粗提液分别调pH值至pH3pH11，然后分装样品分别进行如下处理:4，24 h；37，60 min；65，30 min；80，20 min；l00，15 min。处理后冷却样品，将pH值调至pH7，进行抗菌物活性测定，结果如图7-5。可以看出，纳豆菌抗菌物质具有较好的热稳定性和酸碱稳定性，当温度不超过80时，在pH值在3pH11范围内均比较稳定；100处理时，在pH值为59的范围内稳定。7.3.2.3 酶对纳豆菌抗菌物质的影响将表7-2中的各种酶制剂分别与纳豆菌提取液混合在一起(酶的终浓度为0.5 mg/mL)，37处理

28、l h后，100煮沸5 min 使酶失活，冷却后分别测定抗菌活性，结果见表7-2。由表7-2所示，除中性蛋白酶外，蛋白酶处理lh后，抗菌活性下降明显，特别是对蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶敏感，淀粉酶对抗菌活性无影响。图7-5 纳豆菌抗菌物质的稳定性表7-2酶对纳豆菌抗菌活性的影响试验酶的种类抑菌圈直径（）胃蛋白酶12.0胰蛋白酶10.5胰凝乳蛋白酶9.0蛋白酶K8.5木瓜蛋白酶12.5中性蛋白酶17.0淀粉酶18.5对照19.07.3.3 纳豆菌生产2，6-吡啶二羧酸(dipicolinic acid:DAP) 纳豆菌能产生具有生理活性物质DAP ，它能有效杀灭、抑制肠道内的有害菌和病毒，

29、使肠内菌群达到一个有利健康的动态平衡，增强人体消化机能。不同的纳豆菌种生成DAP的量不同。图7-6为以大豆粉为培养基两种纳豆菌生成DAP的情况。 两种纳豆菌Bacillus subtilis var. natto为高桥菌和宫城菌。将大豆粉配制成0.5%和2%浓度的液态培养基，种子培养液以3%的接种量接种于液态培养基中，37，摇床转速100 r/min震荡培养或静止培养，96 h。采用荧光测定法进行DAP含量分析，其原理是利用DAP 与Tb(terbium)离子形成螯合物，这种螯合物形成的荧光作为指标来测定DAP的含量。图7-7 纳豆菌生产DAP的芽孢率 图7-6表示两种菌发酵生成DAP的结果。

30、高桥菌在0.5%大豆粉培养液震荡培养中生成2.1g/ml的DAP，在静置培养时生成了1.47g/ml的DAP。同样的高桥菌接种于2%大豆粉培养液，无论静置还是震荡培养，只生成少量的DAP。宫城菌接种于0.5%大豆煮汁粉培地，震荡培养生成了1.85g/ml的DAP。与高桥菌相似，宫城菌接种于2%大豆粉培养液，静置、振荡两种方式培养，只生成少量的DAP。这一结果说明DAP的产率与菌种和培养基的浓度以及培养方式有关。在贫营养及震荡状态，芽孢繁殖加速，生产出多量的DAP。这可以由图7-7来解释。该图表示培养后的芽孢对全细胞的比例（芽孢率），两种菌接种于0.5%大豆粉培养液，都有很高的芽孢率。但是接种于

31、2%大豆粉培养液时，芽孢率低，相反高营养物浓度会抑制菌体增殖。可以说，在DAP生产中较贫营养的培养液，有较高的芽孢率，能生产出较多的DAP。7.4 纳豆菌抗菌作用的研发现状7.4.1 国外的研究现状纳豆的抗菌作用早已为人们了解，第二次世界大战期间，人们用纳豆来预防和治疗霍乱、伤寒和痢疾。Ozawa K. 等人研究证实了纳豆菌对白假丝酵母具有抑制作用。Osawa R. 等研究发现纳豆菌产生的枯草杆菌蛋白酶可降解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)。而且，该酶对其它的金黄色葡萄球菌肠毒素亦有作用。1996 年日本发生的O- 157 大肠杆菌中毒事件中，人们发现纳豆菌分泌的一些代谢产物能对一些重要肠道致

32、病菌起杀灭或抑制作用。将纳豆加进O- 157 大肠杆菌4 d 后，大肠杆菌全部被抑制而死亡。Ozawa K研究认为，纳豆菌的芽孢对病原性大肠杆菌(如O- 111，O- 144) 及沙门氏菌具有抗菌作用，还能杀死肠道出血性大肠杆菌O- 157。Fujida S.等采用纳豆菌防治仔猪腹泻取得了良好效果。7.4.2 国内研究现状国内对纳豆菌的抗菌作用的研究的报道较少。江西中德联合研究院的钟青萍等人研究了纳豆菌对常见的污染食品微生物的拮抗作用，结果表明纳豆菌具有广谱抗菌作用，对各种细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌都有拮抗作用。江西农业大学的黄占旺等人研究了不同温度、pH值、培养时间、接

33、种量、盐浓度因素对纳豆菌生长的影响,试验结果表明,纳豆菌生长适宜条件为：温度3045，pH值7.0，培养时间24 h;接种量2%5%。纳豆菌耐盐性较强，在含盐量8%的条件下仍能较好生长。天津科技大学的陈野等人将纳豆菌接种于大豆的豆渣，在豆渣的发酵过程中添加一定的碳源，使其完全发酵，可以获得具有抑菌性的产物。通过抑菌实验可知，豆渣发酵产物具有一定的抑菌效果。钟青萍等还研究了纳豆菌抗菌蛋白的抗菌作用方式以及稳定性，并将其运用于食品防腐中。结果表明：纳豆菌抗菌蛋白对敏感菌起到了杀菌作用。扫描电镜观察表明，抗菌蛋白可以改变细胞形态，使细胞表面粗糙，有凹陷、颗粒和发疱，形状不规则。电镜观察进一步显示，抗

34、菌蛋白引起细胞损伤，并进而使整个细胞受到破坏，起到杀菌作用。纳豆菌抗菌蛋白具有较好的热稳定性和酸碱稳定性。17的NaC1可促进抗菌蛋白的抗菌作用，而二价金属离子(Ca+2、Zn+2、Mg+2) 和三价金属离子(Fe+3) 有一定的抑制作用。EDTA可促进抗菌蛋白的抗菌作用， 山梨酸钾和SE一15亦有增效作用，而卵磷脂和CMC可降低抗菌蛋白的抗菌活性。钟青萍等研究了纳豆菌抗菌蛋自在鲜牛奶和新鲜瘦猪肉中的防腐效果。研究表明，纳豆菌抗菌蛋自在消毒牛奶的保藏中具有显著的防腐效果，样品4 保存2个月后，细菌总数仍低于100 CFU/mL；而对照样品14天时微生物总数超标；37 贮存时亦有较好的防腐效果。

35、在新鲜猪肉的保存中，0.06抗菌蛋白粗品的防腐效果与0.02 尼萨普林的相近。抗菌蛋白与乳酸钠、山梨酸钾和甘氨酸有一定的协同作用。可见，纳豆菌抗菌蛋白适于在食品中应用，且其可与NaC1、EDTA 和食品防腐剂如山梨酸钾等复配，提高抗菌效果。目前只报道过对纳豆菌产抗菌物质的培养条件进行优化，对产生的抗菌活性物质还没有人将其分离纯化出来，需要进一步探讨、研究。现在对纳豆菌抗菌作用的研究主要集中在培养基的选择、液体发酵条件及对致病微生物的抑制作用效果等，但没有具体细化到是什么产物具有抑菌功能。由于纳豆菌能够分泌的多种抗菌物质，它们的作用模式是协同还是其它或单独成分，其机理的研究还有待进一步深入。7.

36、4.3 纳豆菌研发过程中存在的问题目前，国内关于纳豆菌产生的抗菌物质的作用机理、抗菌谱和应用的范围等的研究并不多，也未分离出纯品进行毒理学评价。这是进一步急需探讨的问题。另外，纳豆菌发酵液中存在着一种特殊的味道，不易被大家所接受，如何去除这种异味而又不影响它的抗菌活性，也是需要解决问题。7.4.4 纳豆菌生产抑菌物质的前景不少微生物在其代谢过程中都能产生抑菌物质,但作为食品防腐剂必须符合：生物杀菌素本身对人体完全无害；在消化道内降解为食物的正常成分；对食品进行热处理降解为无害成分；不影响消化道菌群；不影响药用抗菌素的使用等要求。纳豆在日本已经被食用了2000多年,其特性适合于作为天然防腐剂在食

37、品中应用。纳豆菌抗菌物质抗菌谱较广,具有较强的抗菌作用和良好的稳定性,将其应用于牛奶和猪肉的防腐试验证明,纳豆菌作为食品防腐剂具有良好的防腐效果,0.06%抗菌蛋白的防腐效果与0.02%Nisin的效果相近,与乳酸钠等化学防腐剂配合使用效果更好。目前在食品中应用较多的生物防腐剂尼辛、溶菌霉和纳他霉素等,这其中有些产品国内还没有工业化生产,这给食品工业生产中的批量应用带来一定的不便,如果从国外进口,价格昂贵。以天然农产品为原料,用发酵等生物技术而制备,具有高效、无毒、适用性广、性能稳定等优点,成为食品防腐剂研究、应用、发展的一个重要方面。纳豆菌抗菌物质的发酵周期短,投资小,成本低,对环境无污染,

38、可同时生产其他一些有用的副产物,因此,纳豆菌发酵作为新型高效的天然食品防腐剂的开发具有广阔的开发潜力和市场前景。微生物防腐剂抑菌物质的鉴定,抗菌谱的确立,食品毒理学分析等将成为研究的重点。另外,通过生物工程技术对抑菌物质的遗传调控进行研究,具有一定的理论意义及广泛的应用前景。参考文献1.http:www/2.高金燕. 豆渣的营养与药用价值J. 营养保健, 2003, 23 (11) : 49- 50.3. 须见洋行. 纳豆的机能性J. 日本酿造协会志, 1990, 85 (8) : 518- 524.4. 须见洋行, 大杉忠则. 纳豆及纳豆菌中的抗菌成分J. 日本农艺化学志, 1999, 73

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