甘油―卵黄―柠檬酸盐冷冻保护剂中添加二十二碳六烯酸对人精子冷冻前后运动学参数的影响

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1、甘油卵黄柠檬酸盐冷冻保护剂中添加二十二碳六烯酸对人精子冷冻前后运动学参数的影响摘要目的 研究甘油-卵？S柠檬酸盐（GEYC冷冻保 护剂中添加不同摩尔浓度二十二碳六烯酸（DHA）对人精子冷冻前后运动学参数的影响，探索 n-3 多不饱和脂肪酸在人 精子冷冻中的应用价值。方法选取2016年3月2017年4月广东省计划生育专科医院人类精子库的筛查期供精者的 33例精液标本，以GEYC冷冻保护剂为基础，外源性 DHA在 精液-GEYC昆合液中的终浓度分别为对照组0 mmol/L、DHA 1组0.317 mmol/L、 DHA 2组0.634 mmol/L、 DHA 3组1.268 mmol/L。采用SC

2、A 5.2计算机辅助精子分析系统分别检测添 加冷冻保护剂后以及冷冻复苏后08 h的精子运动学参数。结果 冷冻前精液加入各组保护剂后，仅DHA 3组的VCL和VAP显著低于对照组（P0.05）;冷冻复苏后0、4、5、6、8 h , 仅见 DHA 3组偶有运动学参数下降，与其他 3组比较差异有 统计学意义（P0.05）。结论 甘油-卵黄-柠檬酸盐冷冻保护剂 中添加DHA未见冷冻前后人精子运动学参数的提高，适量添加DHA可能通过其他途径对冷冻精子产生影响，大量添加 DHA可能对冷冻前后部分运动学参数有负面影响。关键词 n-3 多不饱和脂肪酸； 精液冷冻；精子运动学参数；二十二碳六烯酸中图分类号 R6

3、91.9 文献标识码 A 文章编号 1674-4721（2018）4（a）-0004-05Influence of addition of different molar concentration of DHA into Glycerol-Egg Yolk-Citrate Cryopreservative Mediums on the kinematic parameters of human sperm before and after cryosurgeryMA Chun-jie1 ZHUANG Jia-ming1 DENG Shun-mei1 TANG Yun-ge2 QIN Wei-

4、bing1， 2 WANG Qi-ling1 ZHANG Xin-zong11.Department of Andriatrics ， Guangdong Institute of Family Planning Science and Technology （ Guangzhou Family Planning Specialty Hospital ），Guangzhou 510600，China；2.Key Laboratory of Male Reproductive and Heredity ， State Health and Family Planning Commission，

5、Guangdong Institute of Family Planning Science and Technology， Guangzhou 510600 ， ChinaAbstractObjective To study the influence of addition of different molar concentration of docosahexaenoic acid （ DHA） into Glycerol-Egg Yolk-Citrate （ GEYC） cryopreservative mediums on the kinematic parameters of h

6、uman sperm before and after cryosurgery so as to explore the application value of n-3 polyunsaturated fatty acids in cryosurgery of human sperm.Methods Altogether 33 cases of semen samples which came from semen donors during human sperm bank screening period in Guangzhou Family Planning Specialty Ho

7、spital from March 2016 to April 2017 were selected.Based on GEYC cryopreservative mediums ， the concentration of exogenous DHA in mixed semen-GEYC liquor were 0 mmol/L in the control group ，0.317 mmol/L in the DHA 1 group ，0.634 mmol/L in the DHA 2 group and 1.268 mmol/L in the DHA 3 group.SCA 5.2 c

8、omputer-assisted sperm analysis system was used to detect the sperm kinematics parameters 0-8 hours after addition of cryopreservation and frozen resuscitation.Results After addition of cryopreservation and frozen resuscitation ， only curve line velocity （ VCL） and average path velocity （VAP） of the

9、 DHA 3 group were significantly lower than those of the control group （P0.05）.After frozen recovery at 0 ，4，5， 6，8 hours，only kinematic parameters of the DHA 3 group decreased occasionally， with statistically significant difference in contrast with 3 groups.After cryosurgery at 0-8 hours ， most of t

10、he kinematic parameters had no statistically significant difference between each group （ P0.05）.Conclusion Addition of DHA into GEYC cryo-preservative mediums do not increase the sperm kinematic parameters before and after cryosurgery.The properaddition of DHA may affect frozen semen through other w

11、ays.Addition of a large number of DHA may have a negative impact on the part of the kinematic parameters before and after cryosurgery. Key wordsn-3 polyunsaturated fatty acids； Semen cryosurgery； Sperm kinematics parameters ； Docosahexaenoic acid精液的冷冻保存是精子库和辅助生殖技术实验室的一 项重要工作。冷冻复温过程能够破坏人精子结构的完整性， 从而影

12、响精子功能。很多动物实验显示，饮食添加 1-6 和冷 冻稀释液 7 中直接添加 n-3 多不饱和脂肪酸( n-3 polyunsaturated fatty acids , n-3 PUFA),尤其是添加二十二碳 六烯酸(docosahexaenoic acid , DHA) ( n-3 PUFA的一种)可 以提高哺乳动物新鲜和冷冻后精液质量。 Vireque 等8 的研 究显示，含有卵黄的人精子冷冻保护剂中添加富含n-6和n-3PUFA的大豆卵磷脂可以使人精子有效抵御冷冻损伤。已知 CASA所检测的运动学参数的结果与体内、体外受精率及受孕所需时间有显著相关性9。DHA是与精子功能相关的最主要

13、 的n-3 PUFA10，在男性生殖过程11-12和动物精子发生及 受精过程中 13发挥非常重要的作用。目前，有关人精子冷 冻保护剂中单独添加DHA对人精子运动学参数的影响却鲜有报道。本文以世界卫生组织( World Health Organization ， WHO)人类精液检查与处理实验室手册第 5版9推荐使 用的甘油-卵黄-柠檬酸盐（glycerol-egg yolk-citrate , GEYC冷 冻保护剂为基础人精子冷冻保护剂，添加不同摩尔浓度的DHA,检测加入含有不同摩尔浓度的冷冻保护剂后以及复苏 后08 h的人精子运动学参数的改变，探索DHA型n-3 PUFA在人精子冷冻保存中的

14、应用价值。1 资料与方法1.1 一般资料选取我？C构人类精子库2016年3月2017年4月的33 例筛查期供精者，年龄 22 36 岁，身体健康，无遗传性疾 病家族史，体检未发现睾丸、附睾及输精管异常。禁欲 2 7 d,用消毒皂洗手，消毒湿巾清洁阴茎和尿道外口，手淫法 取精，精液射入1个干燥无菌的广口取精杯中，37 C水浴充分液化。33例供精者精液标本以 GEYC冷冻保护剂为基础，外源 性DHA在精液-GEYC昆合液中的终摩尔浓度分别为对照组0mmol/L 、DHA 1 组 0.317 mmol/L 、DHA 2 组 0.634 mmol/L 、 DHA 3组1.268 mmol/L。对照组为

15、精液+GEYC冷冻保护剂， 不添加DHA; DHA 1、DHA 2、DHA 3组为DHA添加组，由精 液+GEYC冷冻保护剂+DHA组成，添加的DHA在精液和冷冻 保护剂昆合物中的终浓度分别为 DHA 1 组 0.317 mmol/L 、DHA 2 组 0.634 mmol/L 、 DHA 3组 1.268 mmol/L 。1.2 试剂和仪器试剂GEYC冷冻保护剂按照 WHO人类精液检查 与处理实验室手册 第 5 版的方法进行制备和存储， pH 值为 7.0，细菌培养结果为无菌生长，无精子毒性；DHA 和配制GEYC冷冻保护剂所需的葡萄糖、柠檬酸三钠二水、甘氨酸、 甘油均购买自 Sigma 公

16、司( Sigma， America )。1.2.2 仪器 Makler 计数池( Sefi-Medical Instrument ， Israel)；计算机辅助精子分析 (computeraided sperm analysis， CASA 系统为 SCA 5.2( MicropticInc， Spain)。1.3 方法SCA 5.2系统分析精子运动学参数 各组精液加入到 DHA含量不同的冷冻保护剂后，充分混匀并孵育5 min后，用移液器量取10卩l精液和冷冻保护剂的混合液，加入到 Makler计数池，温度始终保持在 37C,于SCA 5.2系统检测 200 条以上活动精子，获得精子运动学参数

17、，包括平均路径 速度(average path velocity , VAP)、直线速度(straight-line velocity , VSl)、曲线速度(curvilinear velocity , VCL)、精子 头侧摆幅度( amplitude of lateral head displacement ， ALH)、 鞭打频率(beat-cross frequency , BCF)前向性(straightness , STR、直线性(linearity , LIN)。精子冷冻与复温 各组精液与DHA含量不同的冷冻 保护剂混匀并检测精子运动学参数后， 置于液氮上方 1 cm 处 熏蒸1

18、0 min，然后置于液氮中保存。冻存1周后，将精液标本从液氮中取出，室温放置 1 min后置于37 C水浴6 min , 之后按照上述方法分别检测复苏后0、1 、2、3、4、5、6、7、8 h 精子的运动学参数。1.4 统计学分析采用 SPSS 22.0统计软件包对数据进行处理， 计量资料以 均值土标准差（x s）表示，数据比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），以P50%的精液标本中，精子细胞膜DHA的含量明显高于复苏率 50%的精液标本。 Aurich 等15的研究 提示，马因为季节性摄入 PUFA量不同，导致马精子的冷冻 复苏率不同。有研究显示，精子和精液中DHA含量可以作

19、为衡量精子 耐冻潜能和冻后精子授精潜能的一个指标，且精子细胞膜 n-3 PUFA特别是DHA的含量与冷冻后精子运动学参数呈正相 关14; Safarinejad 等 1 6的研究提示，少弱畸形精子症患者 补充n-3 PUFA可以改善精液质量的报道，所以有必要探索在精液里直接添加DHA，提高精子和精浆局部 DHA含量对人精 子的冷冻复苏前后运动学参数的影响，从而进一步影响精子 的受精潜能。本文结合目前国内人类精子库的现状，在人精 子GEYC型冷冻保护液中添加不同比例DHA，研究其对人精子冷冻前后运动学参数的影响，拟探索n-3 PUFA在供精者精子冷冻中的应用前景。结果显示，终摩尔浓度分别为 0.

20、317 mmol/L（DHA 1 组）、0.634 mmol/L（ D HA 2组）、1 .268 mmol/L（DHA 3组）的外源性DHA添加各组，无论是冷冻前还是冷 冻后均未见人精子运动学参数提高。冷冻前精液加入各组保 护剂后，仅摩尔浓度最高组（DHA 3组）的VCL和VAP显著 低于对照组，其他各组间的各项运动学参数差异均无统计学 意义；冷冻复苏后 0、4、5、6、8 h，仅见DHA 3组偶有运 动学参数下降，与其他 3 组比较差异有统计学意义，大部分 时间各项运动学参数差异均无统计学意义。虽然有研究提示 DHA在人精子功能完整性和冷冻过程中发挥重要作用，也与 精子运动学参数息息相关；

21、也有动物实验提示在冷冻保护液 中添加DHA可以提高精液冷冻效果7，但是本研究显示在人 精子GEYC型冷冻保护液中添加外源性 DHA并不能显著提高 冷冻前后的人精子运动学参数。本文的研究结果与人口服 DHA后精液参数变化相似17，试验组人员日服1500 mg富 含 DHA 的油剂 10 周后，精液参数和精子膜脂肪酸组成未见 改变，但是精液的抗氧化水平升高，DNA碎片率降低。DHA对人精子的影响可能不表现在改善精液常规参数，而是表现 在降低DNA碎片率等遗传物质抗氧化方面。最近也有研究人 员报道了类似的动物实验结果，膳食添加n-3 PUFA （来源于微藻类）使牛精子 VPA、VCL、VSL ALH

22、等运动学参数显著 降低，游动距离变短，能量代谢受损 18 ，但是膜流动性显 著增加可能在精子冷冻中发挥作用；不论是膳食单独添加 PUFA还是PUFA和维生素E联合添加，牛持续摄入 60 d后，均对冻融后精子的动力学参数有负面影响19 ；饮食摄入 n-3和n-6 PUFA对奶牛和公羊新鲜精液的精液量以及冷冻前后的 精子浓度和直线性运动精子数无影响，精子膜流动性也无显 著改变20-21。已知PUFA尤其是DHA和DPA,可以促进精 子质膜的流动性。精子冷冻保存的成功率与质膜流动性关系 是：精子质膜适度的流动性有助于冷冻保护剂进入精子细胞 内和精子细胞脱水，但是过高的流动性会损害精子的完整性。 本研

23、究所选用精液均为捐精者的正常精液，外源性添加 DHA 与其他各组发生差异的组也是 DHA 3组，即摩尔浓度最高组， 可能原因就是DHA浓度高导致精子膜流动性也高，反而不能 提高人精子冷冻前后的运动学参数。已有研究显示 14，精 液参数正常的人精子膜的 n-3 PUFA特别是DHA含量，？ 著高于少精症、弱精子症、少弱精子症患者。所以根据本研 究提示的结果，可以进一步研究外源性添加DHA对少精症、弱精子症、少弱精子症患者精液的冷冻效果是否有利；也可 以进一步探索对参数正常人精液冷冻保存最佳的DHA添加浓度以及人精子冷冻保护剂中单独添加DHA后对人精子运动学参数以外的影响，如 DNA碎片率等。目前

24、有关DHA对精液影响的研究主要集中在两个途径， 即膳食添加和直接添加到精液。多数动物实验提示 1-6，膳 食添加n-3 PUFA可以改变精子膜的脂肪酸组成，特别是提高DHA的含量，从而改善新鲜和冻后精液质量。除了饮食添加DHA,有学者尝试在绵羊冷冻保护液里直接添加深海鱼油PUFA（主要成分是 DHA和EPA）7，由于其具有强的膜通过 性，渗透入精子细胞对头部保护，防止了酶的渗出和钙离子 的流入，使解冻后的绵羊精子活力和顶体完整率明显高于未 添加PUFA的对照组。上述两种途径添加DHA又分别有单独添加和联合添加两种。虽然单独添加PUFA在某些物种显示出了一定的改善精子功能的工作，但也有一些研究显

25、示，联 合使用L斗胱氨酸能明显改善解冻后精液质量，特别是精子 的运动能力和完整性，PUFA联合使用维生素 E直接添加到冷 冻保护液22能使PUFA的精子保护作用更稳定。尽管如此， 近期陆续有研究报道膳食添加n-3或n-6 PUFA后不论新鲜精液还是冻后精液参数均无改善 17-21 ， 23，这与本文的研究 结果类似。整理相关文献后发现，出现结论不一致的原因可 能是DHA发挥相关作用与物种有关， 同样地添加途径在不同 物种间发挥的作用可能不同，也可能与PUFA添加的种类和纯度有关。目前，有关PUFA尤其是与精子生理功能密切相关的n-3PUFA对人精子影响的研究处于起步阶段。本研究仅对人冷冻保护剂

26、中单独添加 DHA （ n-3 PUFA的1种）对人精子运动学 参数的影响进行了初步探索，有关正常和不育人群单独添加 DHA或联合添加n-3 PUFA和抗氧化剂对冻后精液影响的研究 正在进一步探索中，通过这些研究将会越来越了解以DHA为代表的n-3 PUFA在人精子冷冻保存中可能发挥的作用? 15.嘉南?1 Ferramosca A，Moscatelli N，Di Giacomo M，et al.Dietary fatty acids influence sperm quality and functionJ.Andrology ， 2017，5（3）：423-430.2 Tran LV，Ma

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