目标蛋白质快速分离系统

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1、目标蛋白质快速分离系统(PF 2D) 蛋白质组学(Proteomics) 研究特定组织/细胞/生物系统中全部蛋白质的结构和功能及其相互关系 发现/寻找新的目标蛋白/诊断标记物/药物/靶标 如何找出有差异的蛋白质如何找出有差异的蛋白质? 蛋白质组学与寻找目标蛋白的工作流程蛋白质组学与寻找目标蛋白的工作流程:蛋白质组学的一个整体解决方案ProteomeLab Strategy 寻找目标材料（组织、细胞、细胞器） (确认目标蛋白的所在位置) Altra / XL流式细胞仪/细胞计数/活度测定仪 Cellomics全自动荧光显微分析系统/A2芯片系统 组织、细胞、细胞器等的分级分离 细胞/亚细胞/细胞

2、器的分级分离 /Allegra TT/Avanti J高效离心机/ Optima 超速离心机/ 淘洗离心机/ Biomek 全自动液体加样器 目标蛋白的快速分离 ProteomeLab PF-2D 目标蛋白快速分离系统 目标蛋白的快速鉴定 ProteomeLab PA 800 目标蛋白快 速鉴定系统/质谱联用系统 / P/ACE MDQ毛细管电泳系统 / DU 800 核酸/蛋白分析仪 / XL-A 蛋白质液体相互作用分析系 / Biomek 蛋白质自动结晶工作站 目标蛋白的评价 A2 蛋白芯片系统/Access 免疫化学发光分析 系统/软件解决方案 / 生物信息学 疾病的诊断 Access全

3、自动免疫分析系统 /诊断蛋白芯片 Altra/ XL 流式细胞仪 各种快速诊断试剂盒和试纸条 蛋白质组分离技术蛋白质组分离技术 凝胶电泳分离技术 色谱分离技术:二维色谱技术/多维色谱技术 毛细管电泳分离技术 其它分离技术(离心等)革命性的ProteomeLabTM PF-2D目标蛋白快速分离系统2001年美国具有重大商业应用价值的年美国具有重大商业应用价值的100项创新项创新的的R&D技术之一技术之一(技术介绍在技术介绍在Genetic Engineering News)ProteomeLabTM PF 2D UV DetectorpHMonitorUVDetectorPA 800MALDI/

4、TOF1st DimensionChromatofocusingFraction Collector/Injector2nd DimensionReverse PhaseESI/MSInjector 色谱聚焦柱色谱聚焦柱( (25 x 0.2 cm ) ) 1.5 um 无孔硅胶（无孔硅胶（NPS）反相疏水分离柱）反相疏水分离柱( (3.3 x 0.46 cm) ) 色谱聚焦起始缓冲液色谱聚焦起始缓冲液(pH 8.5)(pH 8.5) 色谱聚焦洗脱缓冲液色谱聚焦洗脱缓冲液(pH 4.0)(pH 4.0) PD-10 PD-10缓冲液交换柱缓冲液交换柱 技术创新点创新的思路创新的思路: 等电点和

5、疏水性分离的等电点和疏水性分离的结合结合/ 同同时又是一个开放平台时又是一个开放平台/也可进行多维分离也可进行多维分离色谱聚焦分离柱、反向分离柱的技术改进色谱聚焦分离柱、反向分离柱的技术改进独有的软件系统独有的软件系统/最佳的重现性，最佳的重现性，实现蛋白质实现蛋白质差异显示技术和差异蛋白质回收技术差异显示技术和差异蛋白质回收技术实现仪器实现仪器一体化控制平台一体化控制平台/还可与毛细管电泳还可与毛细管电泳和目标蛋白快速鉴定系统共享控制系统和目标蛋白快速鉴定系统共享控制系统 蛋白质组学的创新技术蛋白质组学的创新技术: 成像软件技术成像软件技术将光电倍增管采集的将光电倍增管采集的UV信号转换成图

6、象信号信号转换成图象信号, 进行蛋白质进行蛋白质组的差异显示组的差异显示UV Chromatogram for pI = 7.6-7.9 (Lane 19 )Fraction #1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4*Partial UV/pI Map of Colon Cancer Cell Line Before and After Dosage Treatment. Comparative Maps Produced Using DeltaVue SoftwareuntreatedTreated with drugdifferenceproteolysiselutionpepti

7、desMassSpectrometry传统传统2D凝胶电泳的优点凝胶电泳的优点方法发展早 近年中在方法标准化/凝胶条供应有比较大的发展, 为许多实验室和科学家所采用,有许多经验 国际上有网站/数据库可供比较, 在早期蛋白质的研究和蛋白质组的工作中发挥了不少作用传统传统2 D凝胶电泳的挑战和问题凝胶电泳的挑战和问题1.对低丰度蛋白质的检测来说灵敏度不够对低丰度蛋白质的检测来说灵敏度不够2.是劳动密集性的工作是劳动密集性的工作/费力和费时的操作程序费力和费时的操作程序3.不同实验间蛋白质所在位置的漂移不同实验间蛋白质所在位置的漂移4.不能全面代表膜蛋白或疏水蛋白的真实情况不能全面代表膜蛋白或疏水蛋

8、白的真实情况5.某些蛋白质在等电聚焦缓冲液中低溶解度某些蛋白质在等电聚焦缓冲液中低溶解度 6.蛋白质间着色的差异引致定量的误差蛋白质间着色的差异引致定量的误差7.碱性蛋白检测难碱性蛋白检测难8.特大分子量的蛋白质的检测难特大分子量的蛋白质的检测难9.特小分子量的蛋白质的检测难特小分子量的蛋白质的检测难10. 蛋白质从蛋白质从1D 电转移到电转移到2D凝胶过程中的损失凝胶过程中的损失11. 某些蛋白质带电荷的不均一性某些蛋白质带电荷的不均一性 12. 易受污染易受污染 13. 要求在变性的条件下进行要求在变性的条件下进行关键的优势关键的优势 高上样量是毫克级别(可达5-10mg),加上高回收率,

9、 特别有利于低丰度蛋白质的分离 获得的蛋白质完整性好,保存功能,且在溶液中,易于后续操作, 获得了目标蛋白质进入后续研究 总的分辨率高、速度快/简单自动化目标蛋白快速分离系统特点灵敏度高，有利于低丰度蛋白质的检测灵敏度高，有利于低丰度蛋白质的检测容易自动化，也可直接与质谱容易自动化，也可直接与质谱(MS/MS)(MS/MS)连接连接分辨率高，可获得蛋白质表达谱比较的更分辨率高，可获得蛋白质表达谱比较的更精细信息精细信息配上收集器可进行馏分收集配上收集器可进行馏分收集, ,可获得在溶液可获得在溶液中的蛋白质中的蛋白质 重现性很好重现性很好可获得覆盖面广的蛋白质信息可获得覆盖面广的蛋白质信息 可获

10、得更完整和活性保存更好的蛋白质可获得更完整和活性保存更好的蛋白质可进行差异表达蛋白质的检测和回收可进行差异表达蛋白质的检测和回收酵母细胞裂解液两次进样的酵母细胞裂解液两次进样的UV/pI图谱，其结果表明采用图谱，其结果表明采用ProteoSep方法两次分析的蛋白表达模式重复性好方法两次分析的蛋白表达模式重复性好 重现性好重现性好1st-DIMENSION RESULTSUsing the maximum protein mass of 5 mg for each injection, five successive injections of human plasma were made to

11、 demonstrate the ProteomeLab PF 2D system reproducibility. The first run is at the bottom and the fifth run is on the top. Each run is offset by 0.1 on the absorbance scale for easier viewing.1st-DIMENSION RESULTSThis demonstrates the reproducibility of the pH gradient for the 1st dimension runs for

12、 the five injections of human plasma shown in the previous slide.2nd-DIMENSION RESULTSProteoVue of the 2nd-dimension chromatograms of the pH fraction 6.2-6.5 for the five runs. This demonstrates the reproducibility of the 2nd dimension over five runs. The main peak has a retention time of 15.9 minut

13、es.Run 1Run 3Run 5Run 2Run 41st Dimension Separation, Chromatofocusing: 图: 显示了大肠杆菌（E. coli）细胞裂解液的色谱聚焦分离结果 大肠杆菌大肠杆菌 E. coli O157:H 两个不同株系两个不同株系(Strain)的蛋白质组差异显示分离的蛋白质组差异显示分离E. coli O157:H7 (Penn State 96-0112)E. coli O157:H16 (Penn State 99-1045)蛋白质组学蛋白质组学: 创新的目标蛋白快速分离系统用于创新的目标蛋白快速分离系统用于蛋白质差异表达的鉴定蛋白质

14、差异表达的鉴定Human Plasma from Fasting SubjectHepatocyte Cell CulturePartial ProteoVue map of a yeast proteome. In these 16 fractions collected over the pH gradient it is possible to detect more than 1500 proteins. More than 2500 can be detected in the total collected fractions which includes the basic an

15、d acidic proteins eluted prior to and after the gradient respectively.Yeast Proteome : Part 1Comparison map of protein levels in COS 7 cell extract before (red) and after (green) incubation with heparinized beads快速获得目标蛋白快速获得目标蛋白?快速分离功能蛋白快速分离功能蛋白? 一切从这里开始:PA800 目标蛋白的快速鉴定目标蛋白的快速鉴定蛋白质组学和蛋白质研究蛋白质组学和蛋白质研

16、究的一个重要技术环节的一个重要技术环节 寻找目标材料（组织、细胞、细胞器） (确认目标蛋白的所在位置) Altra / XL流式细胞仪/细胞计数/活度测定仪 Cellomics全自动荧光显微分析系统/A2芯片系统 组织、细胞、细胞器等的分级分离 细胞/亚细胞/细胞器的分级分离 /Allegra TT/Avanti J高效离心机/ Optima 超速离心机/ 淘洗离心机/ Biomek 全自动液体加样器 目标蛋白的快速分离 ProteomeLab PF-2D 目标蛋白快速分离系统 目标蛋白的快速鉴定 ProteomeLab PA 800 目标蛋白快速鉴定系统 /ProteomeLab DU800

17、 核酸/蛋白分析仪 / XL-A/I 溶液中蛋白质相互作用分析系统/Biomek 蛋白 质自动结晶工作站 目标蛋白的评价 A2 蛋白芯片系统/Access免疫化学发光分析系统/软件解决方案/生物信息学 疾病的诊断 Access全自动免疫分析系统 /诊断蛋白芯片/ Altra/ XL/FC 流式细胞仪 / 各种快速诊断试剂盒和试纸条 ProteomeLabTM PA 800标准化的鉴定方法：标准的硬件、 完善的控制和分析软件、配套的试剂盒SDS-Gel MW Analysis (分子量分子量)IgG Gel MW Assay （IgG 测定）测定） Capillary Isoelectric F

18、ocusing (等电点等电点) Carbohydrate profiling (糖谱糖谱) Peptide-mapping - Mass spectral characterization (肽谱肽谱)ProteomeLabTM SDS-MW Gel Chemistry配套的试剂盒/方法/分子量标准品Improved resolution 10,000 to 300,000 MW Standardized methodology Well characterized protein sizing ladderSDS-MW analysis of a Protein Standard ladd

19、er using the new SDS-Gel polymer. 75 um x 20 cm (det) bare fused silica capillary, E.K. sample introductionMinutes2.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.032.535.0AU0.060.070.080.090.100.110.12AU0.060.070.080.090.100.110.12PDA - 220nm01170300110K20K 35K50K100K150K225K3.544.555.51015202530Migrati

20、on Time (min)Log MWLog MWPA 800 应用于全自动SDS毛细管凝胶电泳测定蛋白质的分子量大小：准确、灵敏、快速、简单、符合法规标准SDS-Gel MW Analysis注意10kD与11kD 的分离ProteomeLabTM SDS-MW IgG Assay独有/配套的 IgG 分析试剂盒Standardized IgG Assay Reduced and Non reduced assay methods Includes IgG control, Protein sizing ladder, and all components necessary for the

21、 assaySpecified, validated and supported as an assayMinutes02468101214161820222426283032343638AU0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.030AU0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.030UV - 214nmLL071702 (10% Dex 10% Gly)IgG2H 1L2H1L 1H1HLight ChainBenzoic acidProteomeLabTM carbohydrate labelling and analysis kit 独有

22、/配套的寡糖、单糖、糖蛋白中糖基分析的试剂盒, 进行糖谱的制作Minutes78910111213RFU010203040RFU010203040 Lot 2Lot 1G0G1 G1G2N-Linked Oligosaccharide profile comparing 2 lots of monoclonal IgG2 being assessed as as standard control. PA 800 应用于糖类分析和糖蛋白中的糖谱制作：灵敏、快速、简单、特异性好糊精标准对照品的糊精标准对照品的CE-LIF 见分析和寡糖图谱见分析和寡糖图谱 (每个糖之间相差一个糖基每个糖之间相差一个

23、糖基)APTSFU32100102030102040508030ProteomeLabTM protein methods development kit 蛋白质方法开发试剂盒、蛋白质分离方法的开发和寻找、强酸性蛋白和强碱性蛋白的分析测试RT: 0.00 - 25.00SM: 7B024681012141618202224Time (min)102030405060708090100Relative Abundance19.2117.7011.9614.0912.7815.2116.888.489.830.2622.9122.065.1123.837.142.544.31NL:4.66E8Ba

24、se Peak MS c-tdc-td #806-831RT: 18.91-19.49AV: 26SB: 165T: + c NSI Full ms 300.00-2000.00400500600700800m/z0102030405060708090100Relative Abundance693.24715.33753.20512.19441.11692.49561.14RT: 0.00 - 25.00SM: 7B024681012141618202224Time (min)102030405060708090100Relative Abundance10.8913.1313.4712.6

25、116.1214.289.0516.708.0418.212.1720.252.900.717.374.226.34NL:1.33E9Base Peak MS h-tdh-td #643-673RT: 14.96-15.66AV: 31SB: 165T: + c NSI Full ms 300.00-2000.00400500600700800m/z0102030405060708090100Relative Abundance589.25591.25683.60588.51771.61413.51ChickenHorseGDVEKMGDIEK 693589Horse and Chicken

26、Cytochrome C Tryptic digests, resolved by the ProteomeLabTM PA 800 system interfaced with an LCQ Advantage MS/MS systemPA 800 （与质谱联用）应用于全自动的肽谱制作简单、准确、可靠、提高分辨率CIEF analysis of two different lots of monoclonal IgG2, being assessed as a standard control. The resolving power of CIEF clearly identifies d

27、ifferences in these lots PA 800 应用于全自动蛋白质/肽的等电点测定： 更精确、简单、快速、可区分微小的差异Minutes02468101214161820222426283032340.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.2000.2250.2507.35.9IgG2 lot 27.35.9IgG2 lot 16.886.796.686.556.946.836.606.38ProteomeLabTM PA800完善的仪器控制、数据采集和分析系统32 Karat software ver.7.0符合FDA 21CFR 第

28、11条款可提供IQ、OQ和PQ服务完善的培训教程帮助客户达到GLP/cGMP标准完善的售后技术服务 IgG 研究、开发、生产质量控制：研究、开发、生产质量控制： IgG纯度纯度/异质性分析方法异质性分析方法ProteomeLab PA 800 与与PF-2D共享工作站和软件控制系统共享工作站和软件控制系统ProteomeLab PF-2DProteomeLab PA 800 在蛋白质组学相关领域的应用已有大量研究正在开展: 肝癌细胞、干细胞、细胞周期、愈伤组织、药物治疗/处理前后的细胞/组织/血液样品. 病理细胞/亚细胞器/. 植物抗病、抗盐碱 细菌菌系之间. 揭示生命奥秘/药物靶标/疾病诊断Markers/动植物功能蛋白组/发育生物学/植物品种改良/药物基因组学.