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1、HPLC法柱后衍生测定乳制品中牛磺酸的含量垦l聪最王垒CHINADAIRYINDUSTRYHPLC法柱后衍生测定乳制品巾牛磺酸帕含量姜金斗,刘波,郝岩平(国家乳制品质量监督检验中心,黑龙江哈尔滨150086)摘要:建立了高效液相色谱法测定乳制品中牛磺酸含量的方法.采用荧光检测器,柱后OPA衍生剂衍生,色谱柱为Waerts氨基酸分析柱,柱温为25,流动相流速为0.4mL/min,衍生剂流速为0.4mL/min.标准曲线相关系数为0.9749;回收率为95.6%;8次样品测定SD为0.3832,变异系数为1.2136%.关键词:牛磺酸;乳制品;高效液相色谱中图分类号:TS252.7文献标识码:A文
2、章编号:l00l一2230(2003)04004703DeterminationoftaurineindairybyHPLCderivationaftercolumnJIANGJindou,LIUBo,HAOYanping,(NationDairyTestingCenter,Harbin150086,China)Abstrct:AmethodfordeterminationoftaurineindailYbyHPLCisreported.Fluorscencedetector,Watersaminoacidanalysiscolumnandderivationaftercolumnwasuse
3、dwithcolumntemperature25andspeedofmobilephase0.4mL/minandagentofderivation0.4mL/min.Therelativecoefficientwas0.9749.therecovery95.6%:theSDin8samplebytestingwas0.3832andCV:1.2l36%.Keywords:taruine;dairy;HPLCO引言牛磺酸又称牛胆碱(Taurine),其化学名为2一氨基乙磺酸,是人体最重要的氨基酸之一.普遍存在于动物体内,特别是海洋生物体内,牛奶中牛磺酸的含量极低,而母乳中含量是牛奶中的25倍.
4、牛奶喂养的婴儿发育不如母乳喂养的婴儿,牛奶中缺乏牛磺酸就是重要原因之一.牛磺酸对婴幼儿大脑发育,神经传导,视觉机能的完善,钙的吸收有良好作用,是一种对婴幼儿生长发育重要的营养素.可见用缺乏牛磺酸的牛奶喂养婴儿势必对婴儿的生长发育,特别是智力发育造成影响.国家标准中要求婴儿配方奶粉中必须添加一定量的牛磺酸(0.30mg/g).牛磺酸是一种含硫的氨基酸,易溶于水,不溶收稿日期:20030II8作者简介:姜金斗(1960一),男,高级工程师,从事乳.榆测j仪器分析方面的研究于乙醇,乙醚等有机溶剂.常用的测定方法有:酸碱滴定法,荧光法,氨基酸自然分析仪法,薄层扫描法和高效液相色谱法.随着高效液相色谱仪
5、的普及,目前对利用该仪器进行开发研究测定不同样品的检测技术较多.本研究就是基于高效液相色谱仪研究适于乳粉样品中牛磺酸含量测定的简便,准确,快速的测定方法.l实验仪器与材料1.1主要仪器LC一4A高效液相色谱仪;RF一530荧光检测器;SPD一2AS紫外检测器;WATERS745积分仪;Waters5l0泵及自制的柱后衍生器.1.2试验用试剂2,4一二硝基氟苯(DNFB);乙睛(色谱纯);碳酸氢钠;磷酸氢二钠;磷酸二氢钠;磺基水杨酸;邻苯二甲醛(OPA);乙硫醇;甲醇(色谱纯);硼酸;氢氧化钠;氢氧化钾;柠檬酸三钠;偏磷酸;牛磺Vo1.31,No.42003(total155)酸(生化试剂,进口
6、).试验材料为婴幼儿配方奶粉.2试验方法2.1分析方法的选择一般采用柱前衍生的方法,但所用的衍生剂,色谱柱及流动相等条件各异.本研究共选用了4种方法进行试验.2.1.12,4一二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生,c,柱测定的方法ilI色谱条件:流动相A为(乙睛):V(水)=l:l;流动相B为pH=7磷酸缓冲液;紫外检测器,波长为360nm;流速lmL/min.研究证明,衍生时间难以准确掌握,从而造成样品重现性差.乳粉样品中的牛磺酸与其他成分不能进行有效分离,即5-J-离度差,不能用于乳制品中牛磺酸的测定.2.1.2邻苯二甲醛柱前衍生,C.柱测定的方法色谱条件为:流动相为(甲醇)(乙睛):V(水)=
7、l:l:8;紫外检测器,波长为330nm;流速为lmL/min.试验证明所存在的问题与上法同,仍不能用于乳制品中牛磺酸的测定.2.1.3邻苯二甲醛柱前衍生,ODS柱测定的方法t色谱条件:色谱柱:ODS(250mmx4.6mm,5m);流动相A为(甲醇):V(水)=2:98;流动相B为(甲醇):(乙腈):(水):35:35:30,梯度洗脱.检测波长为330nm.流速为1.0mL/min.浓度为0.4mol/L硼酸缓冲液:称取4.96g硼酸和2.28g氢氧化钠,加水溶解,定容至200mL.衍生剂:称取0.010gOPA,用lmL甲醇溶解,加lOL乙硫醇,浓度为0.4mol/L硼酸钠缓冲液定容10m
8、L(当天配制).通过试验验证,该法存在的问题与前两者相同,仍不能测定乳粉中牛磺酸的含量(原方法为测定金钱莲口服液中牛磺酸含量).2.1.4邻苯二甲醛柱后衍生,氨基酸专用分析柱测定的方法色谱条件为:流动相浓度为1mol/L的柠檬酸三钠1000mL中加入lg苯酚,然后调pH=3.2:衍生剂为0.60邻苯二甲醛用甲醇溶解后加入0.5mL乙硫醇和Brij一35试剂0.35g,再用浓度为0.5mol/L的硼酸钾定容至1000mL;流动相和衍生剂流速都为0.4mL/min;荧光检测器,激发波长为338nm,发射波长为425nm.经试验研究证明,该法准确度与精密度都较好,可以有效分离出牛磺酸的组分,且保留时
9、间在8min左右;分析速度快,样品处理简单.用偏磷酸溶液溶解并沉淀样品后过滤,滤液通过0.45m滤膜后直接上机测定.本研zoos年第s?卷第4期总第一ss期,究采用该法进行试验.2.2色谱分析条件的选择(1)柱温.通过25,35,45,554个柱温试验,表明柱温对样品分离效果影响不大,只是对保留时间稍有影响;低温(25)比高温(55)时稍长.但基本不影响峰高或峰面积.如有柱恒温装置可以使用,若没有也不影响其测定.(2)流动相.由于用氨基酸专用分析柱分离牛磺酸,要求流动相的酸度条件非常严格,所以流动相pH值必须控制在3.103.25间.(3)衍生剂.由于用OPA进行衍生时,必须在碱性条件下,要求
10、pH值为l0左右.柱后衍生所需的氨基酸柱后反应器一般高效液相色谱都不配置,可以自制.采用Waters510泵作为衍生剂溶液驱动泵,用三通作为混合器,用约1.5m长的不锈钢管作为反应器,从而组成了一个柱后反应器系统.经试验验证完全能满足要求.为保持分离的样品与衍生剂混合均匀,稳定,采用相同的流速效果最佳.3结果与分析3.1标准曲线的测定(1)标准溶液的配制.准确称取0.0500g的牛磺酸,用水溶解并定容至50mL,即牛磺酸质量浓度为lg/L的贮备液;然后配制成质量浓度为5,10.0,l5.0,20.0,30.0mg/L的系列标准浓度的溶液.分别上机测定并计算回归方程及相关系数,结果见表l.表l牛
11、磺酸标准曲线测定结果5.0l0.O15.020.O30.O23.546.069.095.0139.0根据表1可计算出的牛磺酸标准曲线的回归方程为y=一0.0072+0.2147,相关系数为r=0.9749.浓度与峰高间呈正相关,相关性好,可用于外标法进行定量测定.3.2样品测定(1)样品处理.准确称取3.00g左右的样品,用质量浓度10g/L的偏磷酸溶液20mL溶解样品后,放入超声波中震荡10min取出,转入5o.mL容量瓶中定容后混匀,用滤纸过滤后滤液通过0.45m滤膜上机测定.(2)样品测定.共选用了5个企业生产的5个婴幼儿配方奶粉进行测定,测定结果如表2所示.表2婴幼儿配方奶粉中牛磺酸测
12、定结果由表2可以看出,两次平行间的相对偏差都在5%以内.样品中牛磺酸与相邻峰间分离度小于l,为1.15tl,基本能进行有效分离(见图1).图1婴幼儿配方粉中牛磺酸测定色谱图3.3回收率与重现性试验(1)回收率试验以1号样品为试验材料,加入标准的牛磺酸溶液,然后再按上述操作步骤进行测定,结果如表3所示.表3牛磺酸回收率试验结果注:平均回收率为95.6%5次重复测定结果回收率在9l%97%之间,平均回收率为95.6%,其准确度可满足测定婴幼儿配方奶粉的要求.(2)精密度试验以3号样品作为试验样品,同时测定8次,结果见表4.由表4经统计分析表明,测定结果的重现性较好,变异系数为1.2l36%.可以满
13、足采用该法测定婴幼儿配方奶粉中牛磺酸含量的要求.(3)最低检出限的测定按试验选定的色谱条件,分别进一定体积的标准样品,根据基线噪声2倍的方法计算出最低检出限,可得出样液中牛磺酸最低检出限为lmg/L.表4精密度测定结果mg/gO.3145O.3l63.31320.3086O.3l5O0.3203O.3l94O.3l87舳CV/%O.3l580.38321.2l364结论(1)通过对三种柱前衍生和一个柱后衍生方法的试验研究证明,柱前衍生由于衍生时间直接影响测定结果,难以准确控制,测定结果重现性较差,且C.柱也不能把牛磺酸与其他成分分离,所以不能用于乳制品中牛磺酸的测定;柱后衍生法,采用专用的氨基
14、酸柱操作简便,衍生条件无人为因素的影响,且样品处理简单,所以采用此法开展牛磺酸测定方法的研究.(2)一般高效液相色谱仪都不配置专用的柱后衍生系统,通过自制的柱后衍生系统:用Waters5l0泵作为溶剂泵,用三通作为混合器,用1.5m左右的不锈钢管作为衍生器构成,经试验证明完全可以满足柱后衍生的要求.(3)经试验研究后认为,采用流动相和衍生剂相同的流速效果较好,可以保证测定的稳定性.其流速为0.4mL/min;柱温采用室温;其保留时间一般为8min左右.上机测定一个样品可在10min内完成.(4)此方法标准曲线线性好,回归方程为y=一0.0072+0.2147,相关系数为r=0.9749,其样液
15、最低检出限为lmg/L.(5)方法回收率与精密度试验结果较好,回收率在91%97%,平均为95.6%,样品测定8次变异系数为1.2l36%.综上所述,采用HPLC柱后衍生的方法测定婴幼儿配方奶粉中牛磺酸含量是一较理想的方法.该法操作简便,易于掌握,其检出限可满足测定精度的需要.因此,可作为常规检测方法应用.参考文献:1】何照范.保健食品化学及检测技术M】.北京:中国轻工业出版社.1998.198200.2】杨祖英.食品检验M】.北京:化学工业出版社.2001.5253.【3】邓思珊.HPLC测定金线莲口服液中牛磺酸含量【J】.海峡药业,2000.12(4).【4】施奈德LR.实用高效液相色谱法的建立【M】.北京:科学出版社.1998.1736.Vo1.31,No.4z胁s,
HPLC法柱后衍生测定乳制品中牛磺酸的含量
