木瓜蛋白酶活力测定方法

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1、木瓜蛋白酶活力测定方法分別精密量取酪蛋白溶液5ml,巻3支具塞试管中，置40C水浴中保温10分钟，精密加入供 试品溶液加1,摇匀，宜40C水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶 液5ml,强力振摇混匀，置40C水浴中放置3040分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤 液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5mlit另一具试管，于40C水浴中保温1小时，精密 加入三氯醋酸溶液5ml,强力振摇混匀，精密加入供试品溶液加1,置40C水浴中放置3040 分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IVA）,以0. lmol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的

2、波长处测怎空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按 下式计算：效价（单位,/mg） =A/As * Cs * 12/2 *稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度，ug/mlW为供试品重星，mg;在上述条件下，释放lug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。试剂 酪蛋白溶液：取酪蛋白lg，力110. 05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,宜沸水浴中煮30分钟， 时时搅拌，冷至室温，力HO. 05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.00.1,并迅速搅拌，防止酪蛋 白沉淀，用水稀释至100ml （临用新配）。酶稀释液：取无水

3、磷酸氢二钠3. 55g,加水400ml溶 解，加乙二胺四醋酸二钠l.lg和盐酸半胱氨酸2. 74g,振摇溶解，用lmol/L盐酸或lmol几氢 氧化钠溶液调肖PH6.50.1,用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋 酸17.99g,加醋酸钠29. 94g和冰醋酸18.9ml,加适量水溶解后,加水使成1000ml,摇匀。酶活力测泄对照品溶液的制备：精密称取已105C干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用 0. lmol/L盐酸溶液制成每lml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当 于木瓜爾活力120万单位），精密称左，加酶稀释液振摇，制成每lml中含20030

4、0单位的溶液, 摇匀。淀粉酶活力测定200S-05-27 13:01 29 g：】213汁论0 字号:去中空一、目的淀粉是匍萄糖以-1,4糖昔键及a-1, 6糖昔键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生 严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。因此，淀粉閒的活性测 立，具有理论和应用研究的意义。通过本实验，学习酶活测眾的一般方法，巩固并熟练分光 光度计的使用。二、原理淀粉

5、酶主要包括u-淀粉酶、B-淀粉酶、匍萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物 中最重要的淀粉酶是-淀粉酶和B-淀粉酶。-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分a-1,4糖昔键，单独使用时最终 生成寡聚匍萄糖、a-极限糊精和少量匍萄糖Ca2+能使 -淀粉酶活化和稳肚，它比较耐热但不耐酸，pH3. 6以下可使其钝化。淀粉酶从非还原端作用于 -1, 4糖昔键，遇到支链淀粉的 -1, 6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和极限糊精。淀粉酶是一种猛基酶，不需 要 Ca2+及 C1等辅助因子，最适pH偏酸，与淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70C保温1

6、5min可使其钝化。通常提取液中u-淀粉酶和淀粉酶同时存在。可以先测左（u + B ）淀粉酶总活力， 然后在70C加热15min,钝化B-淀粉酶，测出（】-淀粉酶活力，用总活力减去淀粉酶活力， 就可求岀B-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用英作用于淀粉生成的还原糖与3, 5-二硝基水杨酸的显色反应来测 定。还原糖作用于黄色的3, 5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一泄时间内生成的 还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。三、仪器、试剂和材料1. 仪器（1）电子顶载天平（2）研钵（3）容量瓶100mL2个（4）具塞刻度试管25M115支（5

7、）试管8支（6）吸管lmL3支,2mL12支，5mU支（7）离心机（8）离心管（9）恒温水浴锅（10）分光光度计2. 试剂（1）1%淀粉溶液（2）0. 4mol/L氢氧化钠（3）pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠樣酸20.01g,溶解后立容至lOOOmL,为A液。称取柠掾酸钠2941g,溶解后泄容至lOOOmL,为B液。取A液13. 7mL B液26. 3mL混匀，即为pH5. 6之缓冲液。（4）3, 5-二硝基水杨酸精确称取lg3, 5-二硝基水杨酸溶于20mLlmol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸佛水，再加入30g洒石酸钾钠，待溶解后用蒸馅水稀释至100M1 ,盖紧瓶塞，防止C02进入。（5）麦

8、芽糖标准液（lmg/ml）称取0.100g麦芽糖,溶于少量蒸馅水,定容至lOOmL.3. 材料萌发3天的小麦芽。四、操作步骤1. 酶液提取称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），宜研钵中加少量石英砂和2ml左右蒸餾水，研成匀浆，无损地转入100ml容疑瓶中，用蒸饴水左容至100ml,每隔数分钟振荡1次，提取20mino 3000r / min 心10min,转出上淸液备用。2. a-淀粉酶活力测泄（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测泄管。（2）于每管中各加酶液hnl,在70C士0.5C恒温水浴中准确加热15min,钝化B-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。（3）在对照管中加入4ml0

9、. 4mol/L氢氧化钠。（4）在4支试管中各加入lmlpH5. 6的柠椽酸缓冲液。（5）将4支试管宜另一个40C士0.5t恒温水浴中保温15min,再向各管分别加入40C下预热的1 %淀粉溶液2ml,摇匀，立即放入40C恒温水浴准确讣时保温5min取出后向测泄管迅速加入4mlO. 4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。3. 淀粉酶总活力测左取酶液5ml,用蒸係水稀释至100ml,为稀释酶液。列取4支试管编号，2支为对照，2支为测泄管。然后加入稀释之酶液lmlo在对照管中加入4ml0. 4mol氢氧化钠。4支试管中各加1mlpH5. 6之柠椽酸缓冲液。以下步骤重复淀粉酶测定第（5）步的操

10、作，同样准备测糖。4. 麦芽糖的测定（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,0. 2, 0. 6,1. 0,1. 4,1. 8, 2. 0ml,然后用吸管向各管加蒸馆水使溶液达2. 0ml,再各加3, 5二硝基水杨酸试剂2. 0ml,置沸水浴中加热5mino取出冷却，用蒸馅水稀释至25mlo混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。（2）样品的测泄取步骤2, 3中酶作用后的各管溶液2ml,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中，务加入2ml3, 5-二硝基水杨酸试剂

11、。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线査出麦芽糖含量，最后进行结果计算。（AAO） xVT五、结果处理式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（陀）；Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；B为（a十B）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）：Bo为（a十B ）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；VT为样品稀释总体积（ml）：VU为比色时所用样品液体积（ml）：W为样品重（g）。六、注意事项（1）酶反应时间应准确计算。（2）试剂加入按规左顺序进行。七、思考题1. 淀粉酶活性测泄原理是什么？2. 酶反应中为什么加pH5. 6的柠樣酸缓冲液？为什么在40C进行保温?3. 测龙酶活力

12、，应注意什么问题？一、目的淀粉是葡萄糖以-1,4糖昔键及a-1, 6糖昔键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生 严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。因此，淀粉酶的活性测 定，具有理论和应用研究的意义。通过本实验，学习酶活测左的一般方法，巩固并熟练分光 光度计的使用。二、原理淀粉酶主要包括a-淀粉酶、淀粉酶、匍萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界

13、。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物 中最重要的淀粉酶是a -淀粉酶和B-淀粉酶。0 -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分a -1, 4糖昔键，单独使用时最终 生成寡聚匍萄糖、a-极限糊精和少量匍萄糖。Ca2+能使 -淀粉酶活化和稳左，它比较耐热但不耐酸，pH3. 6 以下可使其钝化。B-淀粉酶从非还原端作用于a-1,4糖昔键，遇到支链淀粉的-1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和B-极限糊精。淀粉酶是一种猛基酶，不需 要 Ca2+及 C1等辅助因子，最适pH偏酸，与淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70C保温15min 可使其钝化。通常提取液中a-淀粉酶和B-淀粉酶同时存在。可以先

14、测左（u + B ）淀粉酶总活力， 然后在70C加热15min,钝化B-淀粉酶，测岀（】-淀粉酶活力，用总活力减去u-淀粉酶活力， 就可求出B-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用英作用于淀粉生成的还原糖与3, 5-二硝基水杨酸的显色反应来测 定。还原糖作用于黄色的3, 5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一泄时间内生成的 还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。三、仪器、试剂和材料1仪器（1）电子顶载天平（2）研钵（3）容量瓶100mL2个（4）具塞刻度试管25M115支（5）试管8支（6）吸管 lmL3 支，2mL12 支，5mLl 支（

15、7）离心机（8）离心管（9）恒温水浴锅（10）分光光度计2. 试剂（1）1%淀粉溶液（2）0. 4mol/L氢氧化钠（3）pH5.6柠掾酸缓冲液称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至lOOOmL,为A液。称取柠檬酸钠29.41g,溶解后泄容至lOOOmL,为B液。取A液13. 7mL与B液26. 3mL混匀，即为pH5. 6之缓冲液。（4）3, 5-二硝基水杨酸精确称取lg3, 5-二硝基水杨酸溶于20mLlmol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸憾水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馀水稀释至100M1 ,盖紧瓶塞，防止C02进入。（5）麦芽糖标准液（lmg/ml）称取0. 100g麦芽糖,溶

16、于少量蒸憾水,定容至lOOmL.3. 材料萌发3天的小麦芽。四、操作步骤1. 酶液提取称取2g萌发3天的小麦种子（芽长lcm左右），置研钵中加少量石英砂和2ml左右蒸饰水，研成匀浆，无损地转入100ml容量瓶中，用蒸憾水左容至100ml,每隔数 分钟振荡1次，提取20mino 3000r / min离心lOmin,转岀上清液备用。2. a-淀粉酶活力测定（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测建管。（2）于每管中各加酶液lml,在70C士 0.5C恒温水浴中准确加热15min,钝化B-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。（3）在对照管中加入4ml0. 4mol/L氢氧化钠。（4）在4支试管中各加

17、入lmlpH5. 6的柠樣酸缓冲液。（5）将4支试管置另一个40C士 0. 5C恒温水浴中保温15min,再向各管分别加入40 C下预热的1 %淀粉溶液2ml,摇匀，立即放入40C恒温水浴准确计时保温5min-取岀后向测圧管迅速加入4ml0. 4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。3. 淀粉酶总活力测定取酶液5ml,用蒸馅水稀释至100ml,为稀释酶液。期取4支试管编号，2支为对照，2 支为测上管。然后加入稀释之酶液lml。在对照管中加入4ml0. 4mol氢氧化钠。4支试 管中各加1mlpH5. 6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复a -淀粉酚测定第（5）步的操作，同样准备测 糖。4. 麦芽

18、糖的测定（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml） 0,0. 2, 0. 6,1. 0,1. 4,1. 8, 2. Oml,然后用吸管向各管加蒸憾水使溶液达2. Oml,再各加3, 5二硝基水杨酸试剂2. Oml,豊沸水浴中加热5mina取出冷却，用蒸憎 水稀释至25mlo混匀后用分光光度汁在520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标, 以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。（2）样品的测泄取步骤2, 3中酶作用后的各管溶液2ml,分别放入相应的8支25ml 具塞刻度试管中，各加入加13, 5-二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制

19、作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出 麦芽糖含量，最后进行结果计算。（AAO） xVT五、结果处理式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（陀）；Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）：B为（a十B）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）：Bo为（a十B）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；VT为样品稀释总体积（ml）：VU为比色时所用样品液体枳（ml）：W为样品重（g）。六、注意事项（1）酶反应时间应准确讣算。（2）试剂加入按规左顺序进行。七、思考题1. 淀粉酶活性测定原理是什么？2. 酶反应中为什么加pH5. 6的柠檬酸缓冲液？为什么在40C进行保温?3. 测定酶活力，应注意什么问题？如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！