人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究

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1、人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究人中性粒细胞弹性蛋白酶 (human neutrophi l elastase , HNE庇机体各类炎症反映、组织 损伤重构(如肺炎)、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急(慢)性肺损伤、肺水肿、动脉 粥样硬化、硬皮病等病理进程中起重要作用，而且具有增进病毒、细菌的侵人及癌细胞转移的功能。炎症机制研究显示，体内该酶及其内源性抑制剂的平稳失调可致使组织基质降解和 炎症的恶化。目前，国外用HNE卬制剂来医治这一类炎症疾病的研究超级普遍，并已成功开发出第一个以抑制 HNEj医治途径的上市药物西维来司钠(sivelestat sodium hydrate ),从而增进了

2、 HNEW制剂的研究与开发。1 BM的生理、病理作用及结构特点HNE又称人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase , IRE),属于基质金 属蛋白酶类(matrix metalloproteinases,MMPs ),即MMP-12是一种金属离子依托性基质 降解酶，需要微量Zn2+和C?离子的存在才具有酶活性，其底物类型超级普遍， 几乎可降解细胞外基质中的所有蛋白。白细胞、巨嗜细胞、肥大细胞内都存在着这种酶，中性粒细胞中其含量很高，大约每106个细胞中含有 HNE的总量为3 pg。生理条件下，HNEt归够协助清除 异源性物质，增进吞噬细胞排除有害病菌，并帮忙消化受损

3、组织，有助于伤口的愈合与组织再生。而HNB量表达那么会对机体组织、基质造成危害，表现为破坏血管壁组分，使中性 粒细胞更易渗出血管并向炎症部位趋化集中及释放IL-八、TNF-”等炎症因子；它还能降解细胞基质，催化caspase 3诱导的细胞凋亡。据报导，HNE能增强病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附能力，增进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。HNE在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是由218个氨基酸组成的单一肽链，分子质量大约kD,含4个二硫键，是丝氨酸蛋白酶家族一员，因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具 有30%- 40%的同源性，最适 pH值接近中性。HNE勺基因位于19号染色体的短臂结尾，是 50kb

4、的DNA段，成熟的中性粒细胞中并无HNE的mRN献达，说明此种酶只在未成熟的骨 髓细胞中合成。酶的催化中心由 His 4 一、Asp 88和Ser 173三个氨基酸残基组成，空间 位置彼此靠近，均由发夹结构延伸到蛋白表面，其中 Ser残基侧链上羟基具有很高的亲核 性，容易结合不带电的小分子氨基酸，如 Val、Ala、Leu、Met等。2 BM抑制剂HNEM机体会产生各类病理作用，故关于其抑制剂的研究也受到普遍关注，其中包 括内源性抑制剂、合成的外源性抑制剂(蛋白类、拟肽和杂环化合物)和天然提取物等。内源性抑制剂人体内存在许多种针对 HNE的快速反映抑制蛋白，每一种蛋白存在于不同的生理部 位而发

5、挥不同的作用。选择性HNE卬制剂 日afin存在于皮肤及上皮组织中，分子质量为7kD,是酸稳固T多肤；a 1-抗蛋白酶(a 1-antiprotease )在血浆中具高浓度，并由此进入 组织发挥作用。上述内源性抑制剂包括“2-巨球蛋白均为分泌性弹性蛋白酶抑制剂，其中a 1-抗蛋白酶被以为是在体内各类脏器中起主导作用的内源性HNE卬制剂。2.1.1 a 1-抗蛋白酶 它在许多生理、病理进程中(如血液凝结、纤维蛋白溶解、 炎症等)起调剂蛋白分解的作用，而且对避免蛋白水解性组织损伤起重要作用。据报导先本性a 1-抗蛋白酶缺损极易引发肺气肿和自发性肺纤维化( idiopathic pulmonary

6、fibrosis)。a 1-抗蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，存在于血浆中，平均分子质量约50 kD ,含有3个3片层结构和假设干a螺旋结构，其中Met 358决定了它对HNE的抑制特异性，HN*之结合后形成稳固酯结构，致使酶的活性中心构象发生改变，不能去酗:基化，这种抑制机制被称为自杀性底物抑制。对a1-抗蛋白酶的结构研究显示，它和其他HNE抗剂一样，在酶结合位点或周围的Met上的硫醛键对化学氧化超级灵敏，一旦Met被亚碉化后，a 1-抗蛋白酶即失活。在体内氧化自由基的增多是造成这种内源性抑制剂失活的要紧缘故，中性粒细胞分泌出的髓过氧化物酶通过过氧化酶 -过氧化氢-卤化物系统使a i

7、抗蛋白酶氧化失活，从而 达到HNE活性增高，增进细胞渗透转移的目的。 在体外实验中，中性粒细胞中的过氧化物系 统可使a 1-抗蛋白酶在10秒之内失活50% 20秒之内完全失活。2.1.2 Elafin它是一种被研究得比较深切的内源性抑制剂，又称为弹力素，属于Trappin-2基因家族。它在多种上皮组织中表达，如毛囊、食管、阴道和口腔中等。在人皮肤正常组织中没有表达，但在皮肤受外伤和牛皮癣等炎症反映时那么会强烈地表达。翻译后的elafin 蛋白质前体是由117个氨基酸组成的多肤链（kD）,包括由22个氨基酸组成的信号肤，其活性部位在C端，以4个二硫键为中心。在切除信号肽后，该蛋白质变成份子质量为

8、kD的成熟蛋白，即elafin 。研究说明，在HNE诱导的急性肺损伤仓鼠模型中，于诱导前1小时经气管给予 elafin ,其抑制HNE的IC50为科g/kg 。目前对elafin的研究着眼于其在动脉粥样硬化、心脏移植后冠状动脉疾病、心肌坏死和呼吸道炎症等方面的医治成效。异体心脏移植后冠状动脉疾病及其后遗症是器官同意者患有的要紧并发症，发病原理与冠状动脉血管壁增厚有关，而由HNE活性升高引发的弹性蛋白降解沉积、IL-1活性增高、纤维连接蛋白合成、滑腻肌细胞转移等在冠状动脉血管壁增厚进程中起关键作用。在家兔心脏移植模型中，给予重组人elafin能够有效的降低 HNE活性，形态学、免疫组化和生化分析

9、说明，与对照组相较，elafin 给药组家兔的血管壁增厚程度降低70%。将elafin 基因引入嫁接后的血管中，能够有效减少血管嫁接初期的炎症发生和减少细胞外弹性蛋白量；尽管elafin 会致使血管内膜形成减缓，整体上仍具有避免血管粥样硬化恶化的成效。外源性抑制剂对合成类HNE卬制剂的研究已有约 20年历史，其间涌现出大量很有前景的小分子 合成物。但是到目前为止，仅有西维来司钠彳为医治全身性炎症反映综合征（systemic inflammatory response syndrome , SIRS）白H HNE#异性抑制剂上市。合成类 HNE抑制剂又 包括蛋白类、三肽或四肽和氮杂环类化合物等，

10、另外，有报导称3内酰胺类抗生素和苯基丁氮酮类上市老药对 HNE&有抑制作用。2.2.1 蛋白类抑制剂采纳分子生物学的方式，通过对酶与多肽类抑制剂彼此作用的分析研究，能够揭露两种分子的识别方式，从而为蛋白类抑制剂药物设计提供思路。在蛋白类抑制剂的研究中，采纳构建的限制性结构组合肤库，挑选HNE的特异底物，这种方式挑选取得的抑制剂其优势在于分子质量低，且特异性高。有文献报导，从此多肽库中挑选取得的HN即制剂在序列上具有很高的同源性，而且对其重组蛋白的分析说明它们均具有HNE抑制作用，抑制常数 Ki可达65 nmol/L 。在对天然HNEW制剂的研究进程中发觉， 每种抑制剂与 HN印性中心结合的作用

11、位 点（P）几乎都在一个延伸出来的环上，而P1位点上的氨基酸残基要紧决定抑制剂的抑制特异性。HN时易与Pi位点上有小烷基侧链的底物结合，尤其易与Val残基结合。构建的多肽依照天然底物的结构形式，形成环状结构，可将P1位点递呈到酶的活性中心。在此结构基础上，对P1和其他位点的氨基酸残基进行修饰，使之进一步成为对HNEM有高度选择性的化合物。据报导，限制性结构组合肽库一样能够用来挑选a-胰糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶等丝氨酸蛋白酶的抑制剂，而且研究发觉这几种酶的活性中心具有必然的同源性，因此挑选出的大部份抑制剂能够同时抑制这一类酶。2.2.2 西维来司钠2002年11月，氮杂环类化合物西维来司钠（商品

12、名 Hasp。l）在日本上市，其化学名为N-2-4-（2 , 2-二甲基丙酸基）苯磺酰氨基丁氨基乙酸钠，分子质量为D,适应证是全身性炎症反映综合征和急性肺损伤，且正在进行用于呼吸窘迫综合征医?B的n期临床实验。它可改善肺损伤病人的呼吸功能，缩短利用呼吸器的时刻，降低安装呼吸器引发的压力性损伤及呼吸道感染的并发率，减轻或减缓全身性炎症反映综合征及特发性肺纤维化等引发的急性肺损伤；另外，它还能使病人及早离开危险期。由于本品可医治与非典型性肺炎临床表现紧密相关的病症，我国已于2003年5月批准对其进行临床实验,它是我国发生非典型性肺炎后首个通过“绿色通道”加速批准进入临床实验的药物。以琥珀酰-Ala

13、-Ala-Pro-Val-N-对硝基苯胺为底物的酶抑制实验说明，西维来司钠对HN前IC50为土 m mol/L,抑制常数K为土科mol/L。西维来司钠是 HIVE的竞争性抑制剂，而且具有很高的专一性，即便在浓度为100科mol/L时，它对胰蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G等仍没有抑制作用，对猪胰弹性蛋白酶仅有很微 弱的抑制作用，其IC50是对HNE的IC50的130倍。而它对各类实验动物，如小鼠、仓鼠、 大鼠、狗及家兔的中性粒细胞弹性蛋白酶都有抑制作用，且酶学反映测得的其IC50乃至比对HIVE的IC50更小。西维来司钠在各类肺部疾病如肺纤维化、急/慢性肺损伤、肺

14、出血、肺炎、肺癌等的动物及体外模型中均表现出良好的药理作用。给伯莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型静脉注射本品，能够减少成纤维细胞的生成，降低中性粒细胞在炎症部位的聚集数量和炎症因子如 IL-1 3、血小板源生长因子（PDGF、巨嗜细胞炎症蛋白-二、胰岛素样生长因子 A等的m RNAI达。从整体药效来看，与对照组模型相较，西维来司他钠能够明显改善肺纤维化程度， 并要紧作用于发病急性期。目前西维来司钠的药效研究已进一步扩展到用于肺癌、肝癌细胞转移抑制及医治肾炎、胰腺炎等，其应用前景广漠。3 HNE的体外表达研究体外挑选HNE卬制剂利用的酶绝大部份是从人白细胞中提取取得，由于提取本钱昂贵，得率不高，且血

15、液制品缺乏平安性，迫切需要寻觅替代的酶生产方式。为了更快速、有 效、大量的挑选 HNEW制剂，有人进行了 HNE的体外表达纯化。全酶表达由于HNE对大肠杆菌细胞壁组分具有降解作用和在T7启动子表达系统中难以取得有活性的HNE,酶完整cDNA克隆表达研究采纳了 M13噬菌体系统。HNE的cDNA位于人白细 胞株cDNAC库中，由编码 8个氨基酸残基的IL-2前导肽DNA 238个氨基酸残基的 HNE 前体DNA组成，以可溶性蛋白的形式表达，并能够通过赖氨酬:内肽酶切割取得有活性的HNE表达纯化后所得HN属一系列酶活性检测和与抑制剂反映的检测，说明其性质与天然HNE极为相似(见表1)。这种表达系统

16、中，每毫升发酵液能够产生5gHNE(34天)，与天然HNE提取方式相较并无多大优势(每毫升全血中可得Wg HNE)。表1重组HNEffi天然HNEf抑制剂的结合活性比较(Tab comparation of combining activities of recombinantHNE and native HNE with inhibitors )抑制率()抑制剂(/L)重组HNE天然HNE胰蛋白酶抑制剂9373a 1-抗蛋白酶7847糜蛋白酶抑制剂00酶催化结构域表达MMP的催化结构域通常和其完整蛋白酶具有一样的催化成效，而且可被用来进行其抑制剂的挑选，这就使单独表达酶催化结构域多肽片段，以

17、实现高通量挑选药物具有可行性。另外，采纳催化结构域单独作用，还具有比全酶更高的稳固性，可能是因为缺失了C端自我降解结构的缘故。HNE崔化结本域(Phe100-Gly263 )片段DN-缺失前导结构和血液结合素样结构的平头结尾蛋白DNA序列，以pGEMEX：粒为载体，在大肠杆菌中表达，通过复性、提取纯化后取得的每升菌液可产生蛋白量约为23 mg比天然蛋白酶提取法及全酶表达法的产率大大提高。蛋白几乎全数存在于包括体中，经上柱纯化，并在Ca2+、Zn2+存在下稀释复性成为目的蛋白。酶活性分析说明，该蛋白在pH时具有与全酶相同的底物水解能力及相同的底物选择性。经纯化的蛋白质片段对 7036种化合物和1524种混和物进行抑制活性挑选，结果取得27种活性良好的化合物，证明了这一研究方式的可行性。4结语目前，对HNE与其底物及抑制剂之间彼此作用的机制研究已相当做熟，因此基于结构作用理论开展高通量挑选酶抑制剂将会比传统的寻觅方式更为高效、更有目的性。但是，酶表达纯化方面的技术还有待进展和完善。HNE的致病机制已经愈来愈引发人们的关注，其抑制剂的探讨工作仍将继续，且前景看好。