石蜡切片免疫荧光染色方法
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1、对于石蜡切片:1、 烤片:60 60分钟2、 脱蜡:二甲苯中脱蜡15分钟二甲苯脱蜡15分钟无水乙醇5分钟无水乙醇5分钟90%乙醇5分钟90%乙醇5分钟70乙醇5分钟蒸馏水5分钟蒸馏水5分钟。3、抗原修复:高压修复,事先烧开锅中的水,修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠,pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中),上汽后加热10分钟,关火。修复盒取出,放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶:玻片取出放入湿盒,加3%H2O22 (2ml H2O22 加入18ml蒸馏水中,现配现用,避光),室温孵育10分钟,PBS洗3次,每次5分钟。(也可不用去除
2、内源性酶)。3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清(原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子),室温孵育封闭30分钟。如果背景较高,可以4封闭过夜。不用洗,用滤纸吸干周边水分。 从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书,按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS)稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗, 4过夜,第二天取出复温45分钟。PBS洗3次,每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antib
3、ody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗,立即加入稀释好的二抗,室温或4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色,此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。 7. 复染用DAPI对细胞核进行染色,室温10分钟,PBS冲洗5分钟3次,封片(封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1:1混合)显微镜观察,染色后为蓝色荧光。多重荧光染色:可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色,随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186)进行绿色荧光染色,在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色,染色后为蓝色荧光。 0.5molpH9.5碳酸缓冲液配方:NaHCO3 3.7gNa2CO3 0.6g双蒸水溶解至100ml,调节pH至9.5 (注:文档可能无法思考全面,请浏览后下载,供参考。可复制、编制,期待你的好评与关注!)
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