生物工艺学课件

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1、 微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长二：工业化菌种的要求q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物q 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染它种微生物或噬菌体q 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）q 生产特性要符合工艺要求一、工业生产常用的微生物* 从自然界中分离出来就能被利用； 对野生菌株进行人

2、工诱变，得到突变株才能被利用。 使用重组DNA技术改造的菌株目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。工业生产常用的微生物 由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类藻类（alga）、病毒（）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用的生物。 尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。 微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生产的不超过一百多种； 微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十

3、种。可见潜力是很大的。 在工业生产中常用的微生物主要有 工业生产常用的细菌有工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌乳酸杆菌(Lactobacillus lactics) 醋酸杆菌醋酸杆菌(Acetobacter) 棒状杆菌棒状杆菌(Corynebacterium) 短杆菌短杆菌(Brevibacterium) 用于生产：用于生产： 生产淀粉酶生产淀粉酶(amylase） 蛋白酶（蛋白酶（proteinase） 乳酸乳酸(lactic acid) 醋酸醋酸(acetic acid) 氨基酸氨基酸(amino acid) 肌苷酸肌苷酸(ino

4、sinic acid) 细菌（bacteria）： 属于单细胞原核生物（ unicellular prokaryote），），以典型的二分分裂(binary)方式繁殖。 细胞生长时细胞生长时，环状染色体（chromosome）被复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体被分开，继而间隔分裂形成两个相同的子细胞。 如间隔不完全分裂就形成链状细胞。乳杆菌属乳酸杆菌科，因发酵糖产生大量乳酸而命名。存在广泛。嗜酸性，最适ph5.56.0,ph3.04.5仍能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。肠道乳酸杆菌可分解糖产酸，抑制致病菌及腐败菌的繁殖，乳酶生即由活的乳酸杆菌制成

5、，可治疗消化及腹泻。酸牛奶中的乳酸杆菌也有抑制肠道致病菌的作用。龋齿活动状态与唾液乳酸液杆菌计数之间有明确的相互关系。 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。 酵母菌（酵母菌

6、（yeast） 酵母菌为单细胞真核生物（ unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母（petroleum yeast）较多地分布在油田周围的土壤中。 酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的两个细胞。如果子芽不如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。 工业上用的酵母菌有

7、：啤酒酵母啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假、假丝酵母丝酵母(Candida)、类酵母、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒等，用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。真核细胞结构示意图真核细胞结构示意图啤酒酵啤酒酵母母红酵红酵母母啤酒酵母是啤酒生产上常用的典型的上面发酵酵母。菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料酵母，还可以从其中提取细胞色素C、核酸、谷胱甘肽、

8、凝血质、辅酶A和三磷酸腺苷等。 最常提到的酵母酿酒酵母（也称面包酵母）(Saccharomyces cerevisiae)，自从几千年前人类就用其发酵面包和酒类，在酦酵面包和馒头的过程中面团中会放出二氧化碳。因酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。如酿酒酵母作为重要的模式生物，也是遗传学和分子生物学的重要研究材料。 含蛋白质50左右，氨基酸含量高，富含B族维生素，还有丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活性物质。几千年前人类就用面包酵母发酵面包和酒类，在现代食品工业方面，广泛用作人类主食面包、馒头、包子、饼干糕点等食品的优良发酵剂和营养剂。 低糖酵母发酵

9、时，面团一般含糖量7左右，高糖酵母发酵时含糖量则为16。安琪酵母股份有限公司是专业生产面包酵母的公司，产品涵盖所有的面包酵母产品类型，安琪牌活性干酵母（低糖型、高糖型）出口全世界80多个国家 根霉在自然界分布很广，用途广泛，其淀粉酶活性很强，是酿造工业中常用糖化菌。我国最早利用根霉糖化淀粉（即阿明诺法）生产酒精。根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸，还能产生芳香性的酯类物质。根霉亦是转化甾族化合物的重要菌类。与生物技术关系密切的根霉主要有黑根霉、华根霉和米根霉。 黑根霉，也叫面包霉。黑根霉，也叫面包霉。常寄生在面包和日常食品上，或混杂于培养基中，瓜果蔬菜等在运输和贮藏中的腐烂及甘薯的软腐都与其有关

10、，菌丝体分泌出果胶酶，分解寄主的细胞壁，感染部位很快会腐烂形成黑斑。黑根霉(ATCC6227b)是目前发酵工业上常使用的微生物菌种。 有些种类如点青霉（P.notatum）和黄青霉（P.chrysogenum）等可提取青霉素，药用青霉素又称盘尼西林。灰黄青霉（P.griseofulvum）等可提取灰黄霉素。 应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶 放线菌放线菌(Actinomycetes) 放线菌因菌落呈放线状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广。大多腐生，少数寄生。 放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉没培养

11、（submerged cultures）中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度即受遗传性的控制，又与环境相关。 其他生物：其他生物： A: 担子菌（担子菌（Basidiomycetes ）：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药物的开发。 近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。 B：病毒：病毒(virus) 其特点如下： 1. 形体微小，

12、体积比细菌小的多。 2. 没有细胞结构，是一种独特分子的生物，主要由核酸和蛋白质构成。 3. 营寄生生活，由于缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。 人类免疫缺陷病毒 （ human immunodeficiency virus ，HIV ）获得性免疫缺陷综合症（ acquired immunodeficiency syndrome， AIDS ） 噬菌体（phage）是病毒的一种。 ：烈性噬菌体和温和噬菌：烈性噬菌体和温和噬菌体概念与区别。体概念与区别。 噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。 C：藻类（：藻类（alga）： 培养螺旋藻，按

13、干重计算每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。 培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20-35倍。此外，还可通过藻类将CO转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%,合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油、和其他产品。 有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地培植的单胞藻按5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60吨石油燃料。此项技术的应用，还可减轻因工业生产而大量排放CO造成的温室效应。 国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。藻藻 类类

14、 工工 厂厂放线菌（链霉素四环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：第二节 已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点： HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的

15、合成和异亮氨酸的合成调节机制调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌三、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Bo

16、yer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌q 生长迅速、蛋白产量高;q 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；q 外源基因的导入相对容易；q 已建立了整套表达理论及技术.(二) 真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)q 生长迅速，营养要求不高，易培养；q 安全性好；q 比哺乳动物细胞操作简单；q 具有一定的修饰蛋白的能力。 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统q 具有准确的转录后修饰功能；q 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；q 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；q CHO很少分泌自身的内源蛋白。微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切

17、产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：第三节 自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取土样的采取 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题：二

18、、采样时要注意的问题q 气候、水分、空气q 来源q 结合产品的特点q 标签：地点、时间、气候等富集的三种方案：q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法 四、菌落的选出q 从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素q 从形态的角度 菌落的外观形态

19、，是微生物的一个重要表征。如多糖菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天

20、，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型例：醛肟水解酶的筛选例：醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002), 65-72培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落抗动脉粥样硬化药物抗动脉粥样硬化药物 1. 降血脂药（降血脂药（Lipid-lowering drugs ）（1 1）影响胆固醇合成影响胆固醇合成: HMG-CoA还原酶抑制剂还原酶抑制剂 洛伐他汀（洛伐他汀（lovast

21、atin）、辛伐他汀、辛伐他汀(sinvatatin) （2）影响胆固醇吸收和转化影响胆固醇吸收和转化: 胆汁酸结合树脂胆汁酸结合树脂 考来烯胺考来烯胺(colestyramine)（3）影响脂蛋白合成、转运及分解影响脂蛋白合成、转运及分解： 苯氧酸类苯氧酸类:氯贝特氯贝特(clofibrate),吉非贝齐吉非贝齐(gemfibrozil) 烟酸类：烟酸类：烟酸烟酸(nicotinic acid) 3. 3.多不饱和脂肪酸类：多不饱和脂肪酸类：亚油酸等亚油酸等 4. 4.保护动脉内皮药：保护动脉内皮药：硫酸软骨素硫酸软骨素A A 2.2.抗氧化药：抗氧化药：普罗布考（普罗布考（probucol

22、probucol）洛伐他汀洛伐他汀（lovastatin）【不良反应不良反应】1. 胃肠道反应、头痛或皮疹。胃肠道反应、头痛或皮疹。2. 转氨酶升高转氨酶升高用药后用药后1 6个月检测肝功能。个月检测肝功能。3. 骨骼肌溶解症骨骼肌溶解症: 肌痛、肌球蛋白尿、肾功能肌痛、肌球蛋白尿、肾功能衰竭，在合用免疫抑制剂环孢素或降血脂药衰竭，在合用免疫抑制剂环孢素或降血脂药烟酸、吉非贝齐时较易发生。烟酸、吉非贝齐时较易发生。4. 孕妇及哺乳妇女禁用。孕妇及哺乳妇女禁用。 药物设计学药物设计学分子生物学分子生物学结构生物学结构生物学基因组基因组生物信息学生物信息学数学数学统计学统计学药物化学药物化学有机药

23、物化学有机药物化学计算机科学计算机科学计算化学计算化学分子药理学分子药理学一般药理学一般药理学先导物发现先导物发现先导物优化先导物优化互补性互补性相似性相似性多样性多样性包容性包容性反相似性反相似性不相似性不相似性青蒿素青蒿素Artemisinin黄花蒿黄花蒿Artemisia annula蒿甲醚蒿甲醚ArtemetherOOOOOOOOOOCH3生物利用度较低生物利用度较低复发率高复发率高羟基喜树碱羟基喜树碱Hydroxycamptothecin喜树喜树Camptotheca acuminata拓扑替康拓扑替康TopotecanNNOOOOHHONNOOOOHHON(CH3)2水溶性较差，毒

24、性大水溶性较差，毒性大紫杉醇紫杉醇Taxol红豆杉红豆杉Taxus紫杉特尔紫杉特尔TaxotereOAcOHOOCOC6H5OHOAcOOOHNOHOOAcOHOOCOC6H5OHOHOOOHNOHOO紫杉特尔紫杉特尔可卡因可卡因Cocaine南美洲古柯南美洲古柯Erythroxylum coca Lam普鲁卡因普鲁卡因ProcaineNOOOOHH2NOON天然抗生素天然抗生素微生物培养液微生物培养液半合成抗生素半合成抗生素美伐他汀美伐他汀Mevastatin洛伐他汀洛伐他汀 Lovastatin辛伐他汀辛伐他汀Simvastatin普伐他汀普伐他汀Pravastatin桔青霉菌等桔青霉菌等

25、Penicillium citrinum氟伐他汀氟伐他汀FluvastatinOHCOOHHOHR3OOOHOOR2R1HOCOOHOHFN氟伐他汀氟伐他汀基因变异（混合、匹配、交换、突变等）基因变异（混合、匹配、交换、突变等）基因克隆基因克隆多种变异的酶系多种变异的酶系多种非天然的天然物质多种非天然的天然物质 KS AT KR ACP KS AT KR ACP TE KS AT ACP KS AT DH ER KR ACPAT ACP KS AT KR ACP KS AT KR ACPSOSOHOSOHOHOSOHOHOOSOHOOHOSOHOHOHOOSOHOHOOHOHO13131313

26、131313139999991555功能单元1功能单元2功能单元3功能单元4功能单元5功能单元6DEBS1DEBS2DEBS3红霉素A6-Deoxyerythronolide BOOCH3HON(CH3)2OHH3COOCH3H3CH3COCH3OOCH3CH3OHOCH3CH3OHHOH3COHH3COOCH3H3CH3COCH3OHOHCH3HOH3C9136129125563变异酶系或微生物酶系变异酶系或微生物酶系催化小分子化合物转化催化小分子化合物转化多种人工的天然化合物多种人工的天然化合物OOOHHOCH3OOHOHOHOOOOHHOCH3OOHOHOHOOHOOOHHOCH3OOH

27、OHOHOClOOHOHOHHOOOOOHHOCH3OOHOHO脂肪酶酰化糖苷化糖苷酶氧化卤过氧化酶氯代首轮衍生物20个酰化：酯，酰胺碳酸酯氨甲酸酯糖苷化：糖苷氨基糖苷糖酸苷氧化还原：羟基化氧化脱甲基化卤化：氯代溴代碘代第二轮衍生物共600个岩白菜内酯OOOHHOCH3OOCOR1OCOR2OCOR3OHOHOCHOHCH2NHRRHCH3CH2CH3CH(CH3)2C(CH3)2CH2Ph receptor activity receptor activity100200600.2510010002000400065000 blockingNSCH2CH(CH3)N+(CH3)3NSCH2C

28、H2CH2N(CH3)2ClNSCH2CH(CH3)N(CH3)2Promethazine异丙嗪（抗过敏药）异丙嗪（抗过敏药）Chlorpromazine氯丙嗪（安定）氯丙嗪（安定）Thiazinamium噻丙胺（支气管扩张）噻丙胺（支气管扩张）Mafenide(antiinfectious)Tolbutamide (antidiabetic)SNChlorothiazide (saluretic)Cycloguanil (antimalarial)Methylthiouracil(antithyroid)DDS (antileprosy)ClNNNCH3H3CNH2H2NNHNOCH3HSN

29、H2SOOH2NCH2SOOH2NNH2SNHNClSH2NOOOOCH3SOONHCONHC4H9NH2SOOH2NNCONHNH2NCONHNHCH(CH3)2异烟肼 Isoniazid异丙烟肼 Iproniazid苯乙肼 PhenelzineCH2CH2NHNH2司来吉兰 Selegiline反苯环丙胺 TranylcypromineNNH2NHOOGlutethimide格鲁米特（抗癫痫）NHOONH2Aminoglutethimide氨鲁米特（抗雌激素）虚虚拟拟库库专专利利指指导导设设计计库库类类药药原原则则药药代代性性质质潜潜在在毒毒性性受受体体结结构构rainforest soi

30、lmaterial from an underwater vulcanehuman gutsDNA isolation Shearing Tranformation Cloning Multiplication: the host organism multiplies (and obtains) the transformed material. Sequencing 第二节第二节 菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏 一、微生物菌种衰退的原因一、微生物菌种衰退的原因 1. 原因原因 一是菌种保藏不妥; 二是菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件； 三

31、是经诱变获得的新菌株发生回复突变回复突变，从而丧失新的特征的情况。 连续传代是菌种退化的直接原因，这是由于菌种经常处于旺盛的生长状态。 衰退菌株的特点：个体或群体特征发生变化；生产能力降低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境能力降低。概念 确保或恢复菌种优良性能的措施 （一）菌种的衰退形态改变、生长慢、抗逆性差、产量及质量下降表现根源内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 传代过多，条件不适宜返回本节 如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进 行分离复壮。低温干燥无氧缺营养不利条件返回本节（一）保藏目的及原理目的原理创造不利于菌种生长的一切条件，使其代谢处于休眠状态。使菌种不生长不死亡不污染不

32、降低或不丧失其优良性以尽量延长使用时间返回本节 保存方法：保存方法： 应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长期保藏。 酵母菌酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。 霉菌：霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。 细菌和放线菌细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。短期可采用斜面保藏。 保藏应注意的问题保藏应注意的问题： 菌体状态：休眠体 基质：营养贫乏 操作过程：不应对细胞造成伤害不应对细胞造成伤害（二）常用保藏法以母种形式保藏特点简便保藏时间短易污染及退化不适于草菇等菌类 1.斜面低温法斜面菌种置46冰箱中（36个月）返回本节返回本节2.矿油保藏法无菌检验 ？注入种管淹没斜面约1cm矿油处理灭菌：152kpa、30min去水：4050烘至无色透明 口堵胶塞用时转管再转管返回本节返回本节？