红霉素和阿伦磷酸钠防治人工关节松动动物实验研究

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1、红霉素和阿伦磷酸钠防治人工关节松动动物实验研究 作者：陶崑，沈灏，张先龙，王琦，邵俊杰，彭晓春【摘要】 目的应用植骨气囊模型观察红霉素和阿伦磷酸钠防治人工关节松动的效果。方法应用810周大的BALB/c小鼠建立气囊模型，气囊成熟后在气囊内植入同基因小鼠颅骨，同时在气囊内注入超高分子聚乙烯颗粒。实验分4组：空白组气囊和腹腔均注射生理盐水（阴性对照）；颗粒刺激组气囊注射聚乙烯颗粒，腹腔注射生理盐水（阳性对照）；红霉素组气囊注射聚乙烯颗粒，腹腔注射红霉素；阿伦磷酸钠组气囊注射聚乙烯颗粒，腹腔注射阿伦磷酸钠。14 d后处死，取囊壁和植入颅骨组织进行组织形态学和分子生物学检测。结果红霉素和阿伦磷酸钠组破

2、骨细胞激活均受抑制，两者无显著差别。但红霉素组IL-1、TNF和VEGF含量明显下降，气囊炎性反应减轻，而阿伦磷酸钠无此抗炎作用。结论本试验证明红霉素和阿伦磷酸钠均有可能成为延缓和治疗人工关节松动的药物。 【关键词】 红霉素； 阿伦磷酸钠； 植骨气囊； 动物模型； 溶骨； 人工关节松动 Abstract: ObjectiveTo observe whether erythromycin and alendronate are effective in treating aseptic loosening in a murine osteolysis model. MethodAir pouch

3、es were established in the back of BALB/c mice by injecting sterile air subcutaneously. After the air pouches were mature, grafts of calvaria from syngeneic mouse donors were implanted in the air pouches and polyethylene debris was injected into the air pouches. Mice were divided into 4 groups. In t

4、he first group, saline was injected into the air pouches.In the other three groups, polyethylene debris was used. Saline,erythromycin and alendronate were injected intraperitoneally separately.Pouch tissues were collected at 14 days after polyethylene debris administration for molecular and histolog

5、ic analysis.Result Both erythromycin and alendronate inhibited osteoclastogenesis and bone resorption, but alendronate was not as effective as erythromycin in anti-inflammation.ConclusionBoth erythromycin and alendronate can be promising drugs for the treatment of aseptic loosening. Key words：erythr

6、omycin; alendronate; air pouch; animal model; osteolysis; aseptic loosening 人工关节无菌性松动是人工关节置换术的主要并发症，它严重阻碍了人工关节的推广应用。以前的研究大都是通过假体的设计、假体的材料和手术技巧等方面来降低松动的发生。最近的研究是在分子水平模仿人工关节松动的发生过程，应用药物来减少松动的发生。目前临床上还没有统一的预防和治疗人工关节松动的药物。本试验通过小鼠植骨气囊模型来观察大环内酯类抗生素红霉素和二磷酸盐阿伦磷酸钠的治疗人工关节松动的效果。 1 药物、材料和方法 1.1 红霉素和阿伦磷酸钠 红霉素标准品

7、（上海市食品药品检验所）；阿伦磷酸钠标准品（石家庄制药集团） 1.2 聚乙烯颗粒 聚乙烯颗粒由上海市中科院物理研究所提供，应用激光衍射法粒度分析仪和电子显微镜分析颗粒平均直径8.887 m。用70%的乙醇溶液反复冲洗颗粒，并浸泡24 h后用生理盐水洗去酒精，制成生理盐水的悬浮液，浓度为10 mg/ml。 1.3 实验动物 实验选用近交系雌性BALB/c小鼠40只，年龄810周，体重20 g（上海中科院动物实验中心）。处死8只小鼠，取其颅骨作为其它小鼠气囊植骨的供体。将剩余32只小鼠随机分为颗粒刺激组、空白对照组、红霉素组和阿伦磷酸钠组，各8只。 1.4 植骨气囊模型 1.4.1 小鼠气囊模型

8、在小鼠背部选择大约2 cm2 cm大小的皮肤，用酒精消毒，去毛。用25号针头和3 ml注射器在同一个位置，分别于第1，3，5 d，皮下注射1 ml无菌空气，共注射3 ml形成皮下气囊。第7 d气囊形成。 1.4.2 取小鼠颅骨 腹腔麻醉后断颈处死小鼠，在无菌条件下正中切开皮肤，分离小鼠颅骨骨片，将每侧颅骨修整成为4 mm3 mm的骨片，去处周围软组织。注意勿损伤骨表面骨膜。取出的骨组织放置于无菌的生理盐水中，准备植入。 1.4.3 气囊植骨 对气囊小鼠进行腹腔麻醉。在气囊上做一个5 mm长的切口，植入准备好的颅骨骨片；用40的聚丙烯缝线缝合切口。整个过程严格在无菌条件下进行。 1.5 术后处理

9、 24 h后，空白对照组气囊注射0.5 ml生理盐水；颗粒刺激组、红霉素组和阿伦磷酸钠组小鼠气囊内分别各注射含5 mg聚乙烯颗粒和0.5 ml的10%生理盐水悬浮液，以刺激发炎反应和溶骨反应。在颗粒注射前1 d，红霉素组小鼠按照每天每公斤体重2 mg的剂量，阿伦磷酸钠组按照每天每公斤体重0.2 mg的剂量腹腔注射给小鼠，颗粒组小鼠每天腹腔注射同等剂量（0.2 ml）生理盐水，14 d后处死所有小鼠，在无菌条件下取出颅骨和周围囊壁组织进行组织细胞学和分子生物学的检测。 1.6 检测方法 1.6.1 HE染色 原位采集气囊和颅骨组织，保护软组织和颅骨界面不受破坏。HE染色组织切片观察囊壁炎性反应和

10、植入颅骨的表面侵蚀情况。炎性反应主要观察：囊壁的厚度和炎性细胞的渗出数量。每个标本采集4个不同的地方进行分析。囊壁的厚度是通过测量囊壁上6个不同的位置平均计算得到的。总细胞计数是通过测量细胞核的数目得到的。 1.6.2 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP） 破骨细胞表达特异性的酒石酸酸性磷酸酶，TRAP染色是破骨细胞的特异性染色，可以用来观测破骨细胞的激活情况。使用的是国际标准化白血病细胞化学染色诊断试剂盒。将取下的囊壁和颅骨组织做快速冰冻切片，切片厚度为68 m,后按照试剂盒要求染色。胞浆染色呈现深紫色就是TRAP阳性破骨样细胞。在冰冻切片中分离单个TRAP阳性细胞比较困难，总的破骨样细胞的数

11、量是通过软件分析深紫色细胞浆在每个高倍镜视野下所占的累计面积。 1.6.3 ELISA测量细胞因子IL-1、TNF和VEGF含量 将气囊壁和骨组织制成组织匀浆，并提取其上层清液检验IL-1、TNF和VEGF蛋白的含量。试剂盒从R&D公司购买，整个实验按照标准的流程进行。 1.6.4 RT-PCR测量破骨细胞表面RANK（NF-B受体活化因子）的mRNA含量 引物：Rank F:5-caa ctc gac aga tcg cta ca-3 R:5-acg tag acc acg atg atg tcg c-3(315bp) GAPDH F:5-acc aca gtc cat gcc at

12、c ac-3 R:5-tcc acc acc ctg ttg ctg ta-3(450bp) PCR反应在25 l体系中进行，体系含有10 mmol/L核苷酸磷酸(dNTP) 0.5 l，10 mmol/L上下游引物各2 l，cDNA2 l，Taq DNA聚合酶（TOYOBO公司）1 l（5 U/l）。PCR反应首先95预变性5 min后开始循环，循环条件95 30 s，60 30 s,72 30 s,35个循环，最后72延伸10 min。产物电泳分离，测量灰度，目的基因的灰度与管家基因GADPH的灰度进行比对得到目的基因的相对表达量。 1.7 统计学分析 数字图像利用Image Pro Pl

13、us 5.0（IPP）软件来分析。组间比较应用方差分析的方法，使用的软件是SPSS 10.0版本。P值小于0.05表示有显著差异。数据的表达均使用均数标准误差的形式。 2 结果 2.1 一般情况 由于基因同源性高，植入颅骨骨片免疫耐受性较好，32只BALB/c小鼠植骨后无1例感染出现，伤口均一期愈合。 2.2 大体标本观察 聚乙烯颗粒是明显的致炎颗粒。大体肉眼观察可见：空白对照组和红霉素组小鼠气囊囊壁炎性反应不明显，阿伦磷酸钠组其次，颗粒刺激组炎性反应最明显。 2.3 组织细胞学观察 2.3.1 HE染色 镜下可见：空白对照组（图1）囊壁炎性细胞渗出不明显，颅骨表面无明显溶骨；颗粒刺激组（图2

14、）炎性细胞渗出增多，颅骨表面可见较多点状侵蚀；红霉素组（图3）和阿伦磷酸钠组（图4）颅骨表面无明显侵蚀，但红霉素组炎性渗出不明显而阿伦磷酸钠组囊壁炎性细胞渗出较明显。 图像分析统计，小鼠囊壁炎性细胞渗出数结果如下：空白对照组（5 820598）mm2，红霉素组（6 66597）mm2，阿伦磷酸钠组（8 519167）mm2，颗粒组（8 729164）mm2；红霉素组和空白组较颗粒组和阿伦磷酸钠组相比细胞渗出明显减少，差异显著（P0.05）；红霉素组和阿伦磷酸钠组差异显著（P0.05）；阿伦磷酸钠组和颗粒组无明显差异（P0.05）。小鼠囊壁厚度统计结果如下：空白对照组（839） m，红霉素组（8

15、28） m，阿伦磷酸钠组（14511） m，颗粒组（14915） m；颗粒组和阿伦磷酸钠组较红霉素组和空白组相比囊壁明显增厚，差异显著（P0.05）；红霉素组和空白组差异不显著；阿伦磷酸钠组和颗粒组差异不显著。 2.3.2 TRAP染色 在植入骨和囊壁的界面是破骨细胞激活的位置，图5至图8分别是空白组、颗粒刺激组、红霉素组和阿伦磷酸钠组的TRAP染色情况，图中深紫色区域就是破骨细胞激活的位置，可见颗粒组染色最深，阳性染色面积区域最大；红霉素组和阿伦磷酸钠组介于空白组和颗粒组之间。图像分析结果，红霉素组，阿伦磷酸钠的染色面积和空白组、颗粒组的染色面积差异显著（P0.05）；红霉素组和阿伦磷酸钠组

16、之间无显著差异（P0.05）。 图1空白对照组 图2颗粒刺激组(HE染色可见颗粒组炎性细胞渗出增多，囊壁变厚，颅骨表面可见明显的骨溶解反应) 图 3红霉素组 图4阿伦磷酸钠(HE染色可见红霉素组和阿伦磷酸钠组颅骨表面骨溶解反应受抑制。红霉素炎性反应明显受到抑制，而阿伦磷酸钠组不明显) 图5空白对照组 图6颗粒刺激组(TRAP染色可见颗粒组颅骨和囊壁界面有大量的破骨细胞阳性染色区域) 图7红霉素组 图8阿伦磷酸钠组2.4 分子生物学观察 2.4.1 ELISA测量结果 ELISA结果（表1所示），红霉素有明显的抗炎性因子IL-1、TNF-a和VEGF的作用(P0.05)；阿伦磷酸钠无明显抗炎作用

17、(P0.05)。表1 标本浓度值2.4.2 RT-PCR测量结果 OPG/RANKL/RANK信号传导途径是人工关节松动过程中破骨细胞激活的主要途径。RANK是一种膜蛋白受体，存在于破骨细胞前体细胞或成熟破骨细胞表面。上图9所示，上面315bp的条带是目的基因Rank，下面450 bp的条带是内参基因GAPDH，红霉素组和阿伦磷酸钠组目的基因的灰度值介于空白组和颗粒组。统计各组目的基因相对表达，红霉素和阿伦磷酸钠均能降低破骨细胞相关基因RANK的表达，并且和颗粒组相比差异显著（P0.05）。红霉素组和阿伦磷酸钠组之间无显著差异（P0.05）。 3 讨论 人工关节无菌性松动是人工关节置换术的主要

18、并发症。绝大多数学者研究都支持人工关节晚期无菌性松动是由于以下3个过程：（1）磨损颗粒诱发炎症反应释放炎症因子（IL-1、IL-6、TNF、VEGF等）；（2）炎症因子激活破骨细胞（OPG/RANKL/RANK信号传导途径）；（3）破骨细胞溶骨。现在用来研究的药物主要有：二磷酸盐类、大环内酯类抗生素、他汀类、四环素类等1。 本实验通过应用小鼠气囊植骨模型，来观察红霉素和阿伦磷酸钠这两种药物的抗炎性骨吸收作用。气囊模型是一种经典的炎症模型，气囊模型的不足在于缺乏骨组织，无法进行破骨细胞溶骨的相关研究，2004年Ren等2首次对气囊模型进行改良，他们在气囊内植入同基因小鼠的颅骨和股骨，并用磨损颗粒

19、来刺激溶骨。实验结果观察：颗粒刺激组小鼠囊壁和颅骨组织HE染色炎性细胞渗出，骨表面骨吸收，TRAP染色破骨细胞激活。可见，气囊植骨模型是一种模拟人工关节松动的病理模型。和传统的假体植入性的模型不同3，它不需要假体的植入，是一种病理模型。 红霉素属于14-内酯大环内酯类抗生素，它之所以能够引起人们的关注是因为它具有独立于抗菌作用之外的抗炎作用。它能够改善一些慢性的炎性疾病至少有一部分是通过调节核因子kB来实现的4。Ren等5通过体内试验证明红霉素可以抑制磨损颗粒诱发的骨溶解反应。结合本实验结果，红霉素组小鼠气囊炎性反应减轻，炎性因子和破骨细胞激活减少，骨吸收受到抑制。也证明红霉素可以抑制聚乙烯颗

20、粒诱导的炎性骨溶解反应。另一方面作者认为，红霉素的抗炎性骨吸收作用是独立于它的抗菌作用的。首先，实验的4组小鼠（32只），术后无1例感染，伤口均一期愈合；其次，试验中所用的红霉素的剂量是2 mg/kgd-1腹腔注射，这个剂量是临床上抗菌剂量的四分之一；最后，近期的一项研究表明红霉素的一种衍生物红霉素703在丧失抗菌作用的同时却保留了抗炎作用6。可见，红霉素的抗破骨细胞激活作用是独立于它的抗菌作用的。尽管红霉素的结构和它的胃动素样作用已经研究基本清楚，但是其结构和它的抗炎症破骨细胞激活的作用还不清楚。红霉素的临床安全性、有效性和它特有的分子靶点使它有可能成为一种治疗假体松动的药物。 二磷酸盐类是

21、目前研究较多的药物，二磷酸盐进入体内与羟基磷灰石紧密结合,然后在破骨细胞周围释放并进入破骨细胞,抑制胆固醇合成过程,干扰破骨细胞功能,并促进其凋亡7。Bhandari等8荟萃分析290例关节置换术患者，发现术后3个月、6个月和12个月服用二磷酸盐类药物组患者假体周围骨密度明显高于对照组。但是大多数的研究结果都局限在患者术后2年之内，这样假体周围的骨量下降很有可能由假体的应力遮挡而非炎症骨溶解所致。此类药物是否能够抑制人工关节晚期磨损颗粒诱导的假体周围的炎性骨溶解目前还没有定论7。此外，有部分研究提示此类药物伴随有致炎的副作用。从本实验结果看阿伦磷酸钠并没有明显加重气囊植骨的炎性反应。从HE染色

22、和 ELISA的结果来看，阿伦磷酸钠组和颗粒组相比，总体上前者的炎性反应弱于后者。和红霉素组相比阿伦磷酸钠也能起到很好的抑制破骨细胞激活的作用，所以阿伦磷酸钠也有可能成为一种延缓和治疗人工关节松动的药物。目前已经有临床研究来验证阿伦磷酸钠的抗松动效果，至于其他不良反应，还需要进一步的研究和随访。 综上所述，红霉素和阿伦磷酸钠均能抑制破骨细胞激活和骨吸收，只是他们各自作用机制不相同：红霉素可能通过抗炎性细胞激活来抑制破骨细胞溶骨，而阿伦磷酸钠可能通过抑制胆固醇合成，来抑制破骨细胞的。红霉素和阿伦磷酸钠是已被临床使用的，其安全性是有保证的，很有可能成为抗人工关节松动药物。目前研究的重点和难点是如何

23、降低长期使用这些药物的副作用和如何提高假体周围局部的有效药物浓度，并通过大量的临床实验来证明其有效性。【参考文献】 1 张超，汤亭亭，戴尅戎.人工关节无菌性松动药物治疗进展J. 中国矫形外科杂志,2007，6：15.2 Ren W, Yang SY, Wooley PH.A novel murine model of orthopaedic wear-debris associated osteolysisJ. Scand J Rheumatol，2004，33:349-357.3 Fornasier VL, Goodman SB, Protzner K,et al.The role of i

24、mplant alignment on stability and particles on periprosthetic osteolysis-a rabbit model of implant failureJ. J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2004，15，70:179-186.4 Cervin A. The anti-inflammatory effect of erythromycin and its derivatives, with special reference to nasal polyposis and chronic sinus

25、itisJ. Acta Otolaryngol，2001，21:83-92.5 Ren W, Wu B, Peng X,et al.Erythromycin inhibits wear debris-induced inflammatory osteolysis in a murine modelJ. J Orthop Res，2006，24:280-290.6 Desaki M, Okazaki H, Sunazuka T, et al.Molecular mechanisms of anti-inflammatory action of erythromycin in human bron

26、chial epithelial cells: possible role in the signaling pathway that regulates nuclear factor-kappab activationJ. Antimicrob Agents Chemother，2004，48:1581-1585.7 Shanbhag AS. Use of bisphosphonates to improve the durability of total joint replacementsJ. J Am Acad Orthop Surg，2006，14:215-225.8 Bhandari M, Bajammal S, Guyatt GH,et al.Effect of bisphosphonates on periprosthetic bone mineral density after total joint arthroplasty. A meta analysisJ. J Bone Joint Surg Am，2005，87:293-301.15 / 15文档可自由编辑打印