TUNEL法检测细胞凋亡

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1、细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组 DNA 断裂时，暴露的3-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT） 的催化下加上荧光素（FITC）标记的 dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开 ，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断

2、裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与 dUTP上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶 HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕 褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试

3、剂盒是用来检测细胞在凋亡过程 中细胞核DNA的断裂情况。其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3 - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-0H形成，很少能够被染色。针对问题3 （TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：1

4、. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次 510min ;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；2. 把握好细胞通透的时间。 一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用1030min,几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是 37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度，选 择更长的时间，可长至 2h,但要结合你最终的背景着色。4. DAB显色条件的选择。一般 DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30min;我不喜欢

5、用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。5. PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。6. 此外，内源性 POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？1. 蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加膜通透性，使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应；一2. 蛋白酶K一般工作液浓度为 20ug/m

6、l,但浓缩液可配制110mg/ml，可用PBS配制，也可 用蛋白酶 K缓冲液（100mM Tris HCl PH8.0+50mM EDTA ）;3. 蛋白酶K反应时间一般为1030 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4um左右的片子可以用10 min，但30 um左右的可用30 min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。1. 抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中，因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原 性降低，可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来；2. 免疫组化中经常使用抗原修复，因为它的原理主要是抗原和抗体反应，通过抗原修复使 更多的抗原与抗体结合，避免假阴性结果；

7、3. 而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3 0H结合，故不需抗原修复；4. 第一次TUNEL反应只需37度反应1h,或者延长时间即可1. PROMEG公司去年是 40t要3300元（按100ul/片，实际可根据切片大小， 加到30ul/pian ）； 而roche公司一般10t国内分装1300元（同样也是 100/pian ）；2. 两个公司试剂盒内均没有PBS试剂，也不含 DNase（以制作标准对照片）；3. 我一般用4%PFA多聚甲醛，至少浸泡 24 h后进行石蜡包埋、制片。此外，Promega公司在操作步骤中加了两步 4%PFA以固定组织，试剂盒内无PFA但提供了配制方法。再

8、次请教：1. 我做TUNELM染用苏木素几秒钟，请问还用不用1 %盐酸究酒精分化了？2. 我想用罗氏的TUNEL式剂盒做荧光显像，请问用什么封片，配方？ 针对你的问题，我分析如下：1. 盐酸酒精分化的目的：一方面是分色；另一方面是减弱过强的苏木素核染色。所以你若 把握好苏木素着色，也可不分化。2. 分化时间不能过长，否则阳性着色也褪色。3. 一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可，若需长期保存，也可用无色指甲油片周围封 固（必要性不大）。这是我的操作步骤（Promega公司），看完后就知道了：1. 脱蜡：用二甲苯浸洗 5 min X2次；2. 水化：用梯度乙醇（100%x 5 min、100%x

9、 3 min、95%x 3 min、85%x 3 min、70%x 3 min、50 %x 3 min ）；3. 浸洗：0.85 % NaClx 5 min PBS 洗 5 min ；4. 固定：浸入4%多聚甲醛15 min ；5. 浸洗：PBS 5 min X2 次；6. 细胞通透：用每片 100 ul 20 卩 g/ml Protein ase K 处理组织 15 （1030） min RT ；7. 浸洗：PBS洗 5 min ；8. 固定：浸入4%多聚甲醛5 min ；9. 浸洗：PBS 5 min X2 次;10.平衡：加100 ul平衡液，湿盒平衡 10 （510） min ;11.

10、制备TUNEL反应混合液:处理组用1卩l rTdT + 1卩l生物素标记的dUTP+ 98 ul平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100卩l DNase1缓冲液孵育5 min，甩掉液体后再加 100 ul DNase 1（ 10 U/ml ）酶切10 min，用去离子水冲洗4次,PBS浸洗5 min，后面步骤从第10步开始。12.标记反应：加100卩l TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37CX 1 h。13.终止反应：浸入 2X SSC 15 min；14.浸洗：PBS 5 min X3 次；15.封闭 POD 浸入 0.3 % H2

11、O2 15 min ;16.浸洗：PBS 5 min X3 次；17.酶标反应：加 100 ul streptavidin标记 HRP （按 1:500 PBS 稀释）30 min ；18.浸洗：PBS 5 min X3 次；19.DAB显色（避光）：力口 100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB 底物缓冲液+ 50 ulH2O22Q+ 950 ul 三蒸水）10min左右，镜下出现浅棕色背景时。20.用去离子水冲洗几次；21.用苏木素复染，3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100%各1 min ）、二甲苯透明1 min X2次、中性树胶封片。1、蛋白酶k的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高 阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与Triton X100等细胞通透剂。2、蛋白酶K浓度配成贮存液浓度1mg/ ml是可以的，好像工作液浓度是20ug/ml吧，然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20度保存1个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少半年以上（我试过的）。