水母发光蛋白的发现及早期应用

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1、水母发光蛋白的发现及早期应用 广 西 植 物 Guihaia 29 4 : 537 - 540 2009 年 7 月 重组水母发光蛋白及其在植物钙离子信号检测中的应用1 2郝小花 , 张国增1.湖南文理学院 生命科学系 , 湖南 常德 415000 ; 2.河南大学 生命科学院 , 河南 开封 475000摘 要 : 重组水母发光蛋白作为检测植物细胞钙信号的手段是近十几年发展起来的新方法 ,该文介绍了重组2 + 2 + 2 +水母发光蛋白作为 Ca 检测探针的发展过程、 测钙原理、 Ca 浓度检测方法、 Ca 浓度换算方法、 优点与不足、 及在植物细胞钙离子信号检测中的研究进展。并利用国外实验

2、室提供的方法在国内首次得出冷激条件下2 + 2 +植物细胞内细胞质中 Ca 和液泡膜附近 Ca 钙离子浓度动力学变化曲线。cyt md2 +关键词 : 重组水母发光蛋白 ; 钙浓度换算 ; Ca ; 钙信号cyt中图分类号 : Q945 , Q943 文献标识码 : A 文章编号 : 100023142 2009 04205372043Recombinant aequorin luminous protein and itsapplication in measuring calcium signal of plant cell1 2HAO Xiao2Hua , ZHAN G Guo2Zeng

3、1. Department of L i f e Sciences , Hunan A rt and Science College , Changde 415000 , China ;2. Department of L i f e Sciences , Henan University , Kaifeng 475000 , ChinaAbstract : Recently ,the application of recombinant aequorin luminous protein has appeared in measuring calcium signalof plant cel

4、l as a new method. This paper introduced mainly the development of the recombinant aequorin luminousprotein as a probe ,the principle and operates method of measuring calcium concentration ,and how to conversion thecalcium concentration. It summarized the advantages and deficiencies of the protein ,

5、and collected mainly the progressin development studies in measuring calcium signal of plant cell. Meanwhile ,using the method provided by other la22 + 2 +boratory ,the authors got the cold shock kinetics of Ca cyt and Ca md for the first time.2 +K ey words : recombinant aequorin luminous protein ;

6、conversion to the calcium concentration ; Ca cyt ; calcium signal2 + Ca 作为普遍的第二信使在细胞信号转导过 众多令人瞩目的成果。在钙离子信号研究过程中 ,程中起着非常重要的作用 孙大业等 ,2001 ;常芳等 , 水母发光蛋白得到了广泛的应用 ,迅速地使钙离子2 +2005 ,而人们对 Ca 在信号转导中作用的认识 ,则 信号传导网络的研究打开了新的局面。2 +很大程度上取决于 Ca cyt测定技术的发展 郭?等 ,2003 。最近十几年来出现的新型探针有 Ae21 水母发光蛋白的发现及早期应用quorin 水母发光蛋白

7、, yellow cameleon 2. 1 等Sanders等 ,1999 。而 Aequorin 发展最快也最受 Shimomura 等 1962 首先从维多利亚多管水人们的关注。Aequorin 作为检测钙离子新型探针 母 A equorea victori a 中分离出一种蛋白 aequor22 +的使用 ,极大地推动了人们对 Ca 在细胞信号转导 in ,该蛋白在无氧情况下可以发射出波长为 469过程中作用的认识进程。十几年来 ,国内外取得了 nm的蓝色光。与荧光素酶不同的是 ,该蛋白发光3 收稿日期 : 2008203224 修回日期 : 2008209217基金项目 : 湖南省自

8、然科学基金06JJ50042 Supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province06JJ50042 作者简介 : 郝小花 19792 ,女 ,河南巩义人 ,硕士 ,主要研究方向为植物生理与分子生物学 , E2mail yybxiaohua 163. com。原平皓生物 yph-biocom原平皓生物 yph-biocom原平皓生物 yph-biocom538 广 西 植 物 29 卷时不需要低分子量的有机物质做为底物或者辅助因 水母发光蛋白可以重组成有生物活性的水母发光蛋子 ,所以当时被称为光蛋白 p hotoprotei

9、n 。后来的 白 ,此次发现为水母发光蛋白的广泛应用打下了坚研究发现光蛋白是由约 22 KD 的脱辅基水母发光 实的基础。蛋白 apoaequorin 、 氧分子和辅基腔肠荧光素 co2 由此 ,水母发光蛋白在多种细胞类型 哺乳动物elenterazine三部分形成的复合物。其中脱辅基水 细胞、 植物、 酵母等中得到表达 ,产生脱辅基水母发2 +母发光蛋白由 189 个氨基酸组成 ,具有 3 个 Ca 结 光蛋白 Inouye 等 ,1986 ; Rizzuto 等 , 1992 。检测2 +合的 EF hand 结构。腔肠荧光素 coelenterazine 细胞内 Ca 浓度变化时 ,将腔

10、肠素加入到细胞溶液是一个分子量约 400 Da 的疏水基团 ,它可以自由穿 后 ,腔肠素自由穿过细胞膜进入细胞与细胞内翻译、2 +越细胞膜。当 3 个 Ca 与水母发光蛋白结合后 ,引 表达的脱辅基水母发光蛋白组合 ,形成功能性的水起脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素之间的共价键 母发光蛋白 ,上述过程称为重组 recombinant 。水破裂 ,腔肠荧光素被氧化为 coelenteramide ,并释放 母发光蛋白和腔肠素重组后就可以检测不同刺激条2 +件下细胞中 Ca 浓度的瞬时变化。出 CO2 和一个质子 ,同时放出波长为 469 nm 的蓝色光。即 : Knight 等 1993 用体内重

11、组实验证明 2 mol/ L的腔肠素黑暗过夜处理烟草和没处理的烟草相比腔肠素对烟草不产生毒性。而且不断的研究发现 ,水母发光蛋白能忍受一定范围高、 低温的刺激 ,44 时水母发光蛋白仍保持稳定状态 ,但是 50 约Charbonneau 等 ,1985 。44 %的水母发光蛋白被破坏 ;0 的低温不影响水此发射光可以通过生物发光仪来进行检测 ,反母发光蛋白的生物活性。异博定、 La、 Ga、 EGTA、2 + 2 +应的速度取决于 Ca 的浓度。当 Ca 的浓度足够TEA 的处理对于拟南芥也不会造成伤害 Knight 高时 大于 100 mol/ L ,反应速度达到最快 ,所有等 ,1997

12、。的水母发光蛋白都发生反应并释放出质子 ,同时发此后 ,人们相继应用水母发光蛋白这一测钙手2 +出波长为 469 nm 的蓝色光。当 Ca 浓度较低时 ,段测定了拟南芥烟草大豆等多种植物细胞在感受外则仅有部分水母发光蛋白发生反应。界不同的刺激过程中细胞质内的钙信号情况。研究此外 ,水母发光蛋白不能渗透通过完整细胞的表明 ,机械 或吹拂、 激烈摇晃、 震动 触摸、 低渗胁细胞膜 ,因此早期实验中所用的水母发光蛋白是从迫、 冷热冲击、 有氧和无氧胁迫、 盐渍和干旱都可导2 +水母中提取出来 ,通过显微注射的方法将水母发光致 Ca cyt水平快速而短暂的变化。变化的持续时2 +2 +蛋白注射到细胞内

13、 ,用来监测细胞内 Ca 的动态平间对每种信息而言是特有的 ,不同的 Ca cyt变化衡 Shimomura ,1997 。1967 年 Ridgway & Ash2引发不同的生理反应。从而确立了水母发光蛋白在ley 1967就首次将纯化的水母发光蛋白显微注射检测植物细胞钙信号中的地位。到动物细胞中 ,并检测到了肌纤维细胞中钙信号的瞬时变化。但该方法对实验技术要求较高 ,因此限3 钙离子浓度的换算制了水母发光蛋白的应用。在此后 20 年间 ,其应用2 +仅限于从水母中提取、 纯化发光蛋白 ,并显微注射到水母发光蛋白一旦和 Ca 反应即丧失发光功2 +细胞内用以研究感兴趣的钙信号。能 ,因此当一

14、部分水母发光蛋白与 Ca 反应时 ,被2 +消耗水母发光蛋白的发光强度能反映出 Ca 浓度2 水母发光蛋白的 cDNA 克隆及变化 ,而且被消耗的水母发光蛋白的发光强度与2 +Ca 浓度之间存在一种线形关系 Knight 等 ,体外表达1997 。因此通过生物发光仪检测水母发光蛋白发2 + 1985 年 , Prasher 等 1985 从维多利亚多管水 光强度就可以换算出 Ca 的相对浓度 Cobbold &母中克隆并分离出了脱辅基水母发光蛋白的 cD2 Rink ,1987 。换算公式为 :pCa 0. 332588 - log kNA ,并将其在大肠杆菌中表达 ,再孵育可自由穿越 + 5

15、. 5593细胞膜的辅基腔肠荧光素后 ,腔肠荧光素和脱辅基 K是一个常量 ,即每秒种记录的发光总和原平皓生物 yph-biocom原平皓生物 yph-biocom原平皓生物 yph-biocom4 期 郝小花等 : 重组水母发光蛋白及其在植物钙离子信号检测中的应用 5392 +Knight 等 ,1991 。由此 ,人们可以得到直观的相水母发光蛋白还能用来连续几周测定 Ca cyt2 +对钙离子浓度 ,单位为微摩尔 mol/ L 。生物发光的变化。比如 ,查到在白光和红光下 Ca cyt的节2 +仪的检测一般可设定为每秒记录 5 次 ,按照预测的奏性震荡 ,在黑暗下消失 ;相反 ,叶绿体中 C

16、a 的节细胞反应时间 ,记录相应的时长 ,得到原始数据。目奏性震荡却始于黑暗开始时。细胞内两个不同部分2 +前 ,国内已有计算机专业人员将此计算方法编写程 Ca 的差别可能是形成光周期机理的基础。此2 +序可对输出的大量原始数据进行快速的批量处理。外 ,利用水母发光蛋检测 Ca 浓度变化可在整体水平进行 ,也可在任何类型的细胞中进行。4 细胞内定位表达及新应用作为一个蛋白质 ,加上特异性的靶序列后 ,这种重组蛋白可以精确地在细胞内定位 ,这是人们对水母发光蛋白感兴趣的另一个重要原因 Haley 等 ,1995 。用这种方法 ,可将水母发光蛋白定位于细胞2 +内不同部位 ,成为研究 Ca 信号时

17、空复杂性的新工具。Knight 等 1991构建了表达脱辅基水母发光蛋白定位于细胞质的质粒 p MAQ。并得到了转化图 1 冷激条件下 ,细胞质CYT中、 液泡膜附近MD钙的烟草 N icoti ana pl umbagi ni f oli a 植株 ,利用转离子浓度变化动力学曲线 每个结果重复 5次以上2 + 2 +Fig. 1 Ca cyt and Ca md Cold Shock Kinetics基因植物报告了触摸、 冷休克和真菌激发子等因子2 +Traces are averages of five individual seedlings刺激时细胞质中 Ca 浓度的变化。而且该实验也

18、证明 2 mol/ L 的腔肠荧光素过夜处理烟草 ,对烟 2000 年 , Knight 利用水母发光蛋白的细胞内特草也不会产生毒性。 异表达载体 Kiegle 等 ,2000转化拟南芥 ,从而得到1996年 , Knight 等 1996又构建了表达脱辅基在拟南芥根的表皮、 表皮和皮层伸长区、 内皮、 中柱水母发光蛋白定位于液泡的细胞质面的质粒鞘等部位定位表达脱辅基水母发光蛋白的植株 ,在HVA122. 2 ,并检测得到了冷刺激下细胞质中钙离一定的刺激条件下 ,得到不同的钙离子浓度变化的子浓度的变化 ,得到了液泡膜附近钙离子浓度变化 动力学曲线 ,证实对于一定的刺激 ,不同类型的细胞的动力学

19、曲线。反应也不同。本文利用 Heat her Knight 教授提供的载体 ,通水母发光蛋白除在检测植物细胞内钙离子浓度过 Floral dip 法转化拟南芥 A rabi dopsis t hali ana方面有很大的应用和发展之外 ,在其它方面的应用野生型 Columbia col20 ,获得在细胞质中和液泡膜也十分广阔。以前因为技术困难 ,很少有人注意植附近特异表达脱辅基水母发光蛋白的植株。参照文物细胞信号传导过程中线粒体钙离子的作用。2003献提供的方法 Cobbold & Rink 等 ,1987 ; Knight 年 ,David等 2003 通过能稳定表达水母发光蛋白等 ,199

20、6 ,得到了冷刺激 cold shock 下细胞质和液 的拟南芥 ,并定点到线粒体中以用于研究分析植物2 +泡膜附近钙离子浓度变化的动力学曲线 图 1 此线粒体中钙离子变化和揭示 Ca m 的独立调节。实验在河南大学植物逆境生物学实验室完成 。同样 ,钙离子信号途径在丝状真菌中的情况了解得水母发光蛋白能进行选择性的定位 ,因此该方非常少。2004 年 ,Nelson 发展了一种基于重组水母2 + 2 +法明显优于利用 Ca 荧光染料的方法标定 Ca 浓发光蛋白的方法来进行此研究 Nelson & Kozlova ,度。目前水母发光蛋白已被成功定位于细胞核 2004 。通过密码子优化 ,已得到高

21、水平表达水母蛋Pouly等 ,2001 、 叶绿体 Sai & Johnson ,2002 、 细白的 N euros pora crassa , A s pergill us ni ger 和 A s2胞外基质 Gao 等 , 2004 及植物液泡的细胞质面 pergill us aw amori 菌株。Knight 等 ,1996 。并已得到转化植株。通过对这 2007年 ,舒柏华等 2007 利用水母发光蛋白生些转化植株的研究 , 证实细胞器能和特异的物发光分析技术建立了一种 PCR 产物定量检测技2 + Ca cyt信号结合。术。实验证实 ,该定量检测技术是一种灵敏的、 可靠原平皓生物

22、 yph-biocom原平皓生物 yph-biocom原平皓生物 yph-biocom540 广 西 植 物 29 卷2 +的、 非放射性的基因微量定量方法。Ca 浓度应用范围和测量准确度。但实际上 ,半合成的水母发光蛋白缺少稳定性且量子产率明显低于天然的水母发光蛋白 ,因此限制了其应用 Shimo25 优缺点及展望mura 等 ,1993 ;Montero 等 ,1997 。对于植物细胞而言 ,叶绿体有自发的荧光 ,同时 通过水母发光蛋白基因与细胞特定区域定位信植物体内也存在其它微弱荧光。但这两种荧光的强 号构建的重组基因和在植物体内重组表达 ,使该技度与植物体内重组的水母发光蛋白的发光强度

23、相比 术既能检测细胞质内钙离子的变化 ,又能准确定位2 +非常微弱 ,对于应用水母发光蛋白检测细胞内 Ca 到大多数的亚细胞结构等细胞器 ,进而检测这些细浓度的变化不会产生太大干扰 Knight 等 ,1993 。 胞器中的钙离子变化。这对植物细胞钙信号的局部将水母发光蛋白转入到植物中 ,获得细胞内稳定表 与整体变化的研究无疑是一个推动 ,大大促进了植达水母发光蛋白的转基因植物 ,可以在整体水平上 物细胞钙信号的研究进程。在其它方面 ,如舒柏华2 +简便而快速地测定细胞内 Ca 浓度的瞬间变化。等利用水母发光蛋白与 PCR 相结合 ,建立的 PCR避免了以原生质体为材料的诸多不便 ,同时也使实

24、 产物定量检测技术就是在新领域的新发展。但一段验得以在更接近自然状态的情况下进行。 时间内 ,水母发光蛋白还需一定的改进和完善。重组水母发光蛋白之所以在测定植物细胞钙信参考文献 :号中得到广泛应用 ,主要是因该方法有以下优点 :孙大业 ,郭艳林 ,马力耕 ,等. 2001. 细胞信号转导 M . 第 31 对细胞无伤害 ,不影响其正常的生长发育 ; 2 不版. 北京 :科学出版社 ,211外泌 ,不在细胞内区室化或凝集 ,能在较长时间内检Chang F常芳 ,Cui SJ 崔素娟2005. Recombinant luminous pro2测钙离子信号 ; 3 不需激发光源 ,因而消除了细胞

25、tein and its application in measuring calcium signal of plant cell 重组发光蛋白及其在植物细胞钙信号检测中的应用 J . Plant自发荧光的干扰 ; 4加信号肽后能准确定位。因Physiol Commun 植物生理学通讯 ,411 :77 - 83此 ,在钙离子信号研究过程中 ,水母发光蛋白迅速得Charbonneau H ,Walsh KA ,McCann RO ,et al. 1985. Amino acid到广泛应用 ,并极大地推进了钙离子信号研究进程。sequence of the calcium2dependent

26、photoprotein aequorin J .B iochemistry ,24 :6 762 - 6 771在试验过程中 ,也存在一些问题 ,虽然水母发光Cobbold PH , Rink TJ1987. Fluorescence and bioluminescence蛋白可以在植物体内广泛或选择性表达 ,但腔肠荧measurement of cytoplastic free calciumJ . Biochem J , 248 :313光素的过膜渗透可能不太理想。腔肠荧光素可能很- 3282 +难进入深层组织细胞 ,对 Ca 浓度的检测可能存在 David C. Logan , Mar

27、c R. Knight. 2003. Mitochondrial and cy2tosolic calcium dynamics are differentially regulated in plantsJ .一些影响。同时 ,由于细胞壁的物质障碍 ,使得植物Plant Physiol ,133 :21 - 24表层 23 层以下细胞发出的荧光无法测量 ,发光读Gao DJ , Knight MR , Trewavas AJ2004. Self2reporting A rabi22 +数主要来自于表层细胞 Rizzuto 等 ,1992 。因此 ,dopsis expressing p H

28、and Ca indicators unveil ion dynamics inthe cytoplasm and in the apoplast under abiotic stressJ . Plant也有研究者利用悬浮培养的细胞进行试验 ,并证明Physiol ,34 :898 - 908螯合细胞外的钙离子可以诱发细胞内钙库钙离子的Guo W郭? ,Ren ZY任兆玉 , Hou X侯洵2003. Fluores2释放 Step hen 等 ,2001 。同时 ,aequorin 也还存在cence methods for analyzing intracellular second m

29、essenger2calci2其它的一些不足 : 1 需预先与发光辅基进行重组 ; um ion 细胞内第二信使 ? ?钙离子荧光测定方法的研究进展 J . L aser J 激光杂志 ,24 1 :1 - 52测钙过程中发光辅基为不可逆消耗 ; 3产生的Haley A ,Russell AJ ,Wood N ,et al. 1995. Effects of mechaniscal光信号较弱需要用高灵敏度的生物发光仪检测 ; 4signaling on plant cell cytosolic calcium J . Proceedings N a2不适用于单个细胞中钙信号的研究。tional

30、 Academy Sci ,US A , 92 :4 124 - 4 128Inouye S ,Sakaki Y, Goto T ,et al. 1986. Expression of apoaequor2对于辅基腔肠素来说 ,目前除了标准的腔肠荧in complementary DNA in Escherichia coli J . B iochemistry ,光素外 ,还合成了几种腔肠荧光素的类似物 : h2co225 :8 425 - 8 429elenterazine、 ip2coelenterazine、 coelenterazine 18 及Kiegle E ,Moore CA

31、, Haseloff J ,et al. 2000. Cell2type2specific cal2e2coelenterazine Knight 等 ,1991 。这些腔肠荧光 cium responses to drought ,salt and cold in the A rabi dopsis rootJ . Plant J ,23 :267 - 278素类似物重组的半合成水母发光蛋白具有不同的光Knight H , Trewavas AJ , Knight MR. 1996. Cold calcium signal22 +发射特征和 Ca 敏感度 Shimomura 等 ,1993 。从下转第 501页 Continue on page 501理论上看 ,这些半合成的水母发光蛋白具有更大的原平皓生物 yph-biocom原平皓生物 yph-biocom原平皓生物 yph-biocom