单克隆抗体技术研究进展与应用

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1、单克隆抗体技术的研究进展与应用生命科学学院2011级 * 201101*摘 要： 自1975年，Kohler和Milstein共同建立杂交瘤技术首次产生单克隆抗体以来，单克隆抗体经历了鼠源性、人源性和全人化三个阶段。迄今为止世界上已经研究出上千种单克隆抗体，并广泛应用于生物学和医学领域。关键词：单克隆抗体技术 发展历程 应用 展望 单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）是将能够产生抗体的单个B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯的单克隆细胞系而产生的。它只能识别某一种特定的抗原表位（抗原决定簇）。单克隆抗体具有高度的特异

2、性和均一性，且能够大量制备，在疾病的预防、诊断和治疗方面显示出重要的作用。此外，单克隆抗体技术还被广泛应用于生物技术、农业、食品等领域。自上个世纪80年代以来，单克隆抗体经历了鼠源性、人源性和全人化抗体三个阶段。本文主要从单克隆抗体技术的发展历程、应用和展望三个大方面进行综述。1 单克隆抗体技术的发展历程1.1 鼠源性单抗 1975年，Kohler和Milstein共同建立了杂交瘤技术，将小鼠骨髓瘤细胞与产生绵羊红细胞抗体的小鼠脾细胞融合，首次获得人工制备的单克隆抗体，为抗体的研究和应用带来了突破。 该技术主要包括免疫动物、细胞融合和杂交瘤细胞的筛选三个环节。现阶段，所产生的McAb大部分是通

3、过这种杂交瘤技术得到的鼠源性McAb，其在临床上还存在很大的弊端。首先，由于其多为鼠源性，具备免疫原性，引起人体产生免疫反应，产生人抗鼠抗体，产生人抗鼠抗体，从而降低McAb的应用价值。其次，McAb在人体内半衰期比较短，常不能有效激活抗体依赖细胞介导的细胞毒反应和补体依赖的细胞毒反应。再次，鼠源性McAb与自然杀伤细胞等免疫细胞的亲和力较弱，并且产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用以及对肿瘤细胞的杀伤力也较弱。另外，传统杂交瘤技术还存在制备周期长，成本较高，杂交瘤细胞不稳定和抗性易丢失等缺陷。近年来，随着分子生物学的发展，出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术所制

4、备的单克隆抗体。这些技术可有效解决传统杂交瘤技术所存在的问题。为单克隆抗体的发展提供了广阔的空间。1.2 人源性单抗 嵌合抗体产生于1980年代中期，是将非人源抗体可变区移植到人抗体恒定区，应用DNA重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组，再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物，选用适当的抗生素或试剂进行筛选，再用与传统杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。但这种抗体仍保留了原来鼠源抗体约30%左右的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应。 为了进一步提高嵌合抗体的人源化，在嵌合抗体的制备过程中，又引进了重构抗体技术和表面重塑技术以进行人源化改

5、造。重构抗体是与异源抗体和抗原的结合相关的，它分为互补决定区（简称为CDR）移植抗体和特异性决定残基（简称为SDR）移植抗体。CDR移植抗体将鼠源单抗上的6个CDR，通过分子克隆的方法，克隆到人抗体相应的框架区。仍残存少量异源基因，仍可引起免疫排斥反应。并不是整个CDR都参与抗原的特异性识别，在CDR区中仅一部分氨基酸残基与抗原结合，这些氨基酸残基决定抗体的特异性，称为SDR。SDR移植抗体仅将异源抗体CDR区内与抗原结合关系密切的SDR，移植到人抗体相应位置上，使人源化抗体的免疫原性进一步降低。但SDR移植抗体和CDR移植抗体一样存在亲和力和特异性降低的缺点。目前重构抗体是对鼠源性单抗人源化

6、改造最常用、最基本的方法。而表面重塑抗体技术是对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸进行替换。所替换的片段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区构像的残基要尽量保留。 到目前为止，治疗性单抗的商品市场基本由嵌合单克隆抗体主宰，虽然抗体人源化程度在不断提高，但是由于鼠源成分依然存在，并未完全解决鼠抗体的免疫原性问题，而且人源化程度较复杂，造价也比较高。1.3 全人源性单抗的制备 完全人源性抗体才是应用于治疗的最理想抗体，研究者已经创建了一系列方法来制备此抗体。主要包括噬菌体抗体库技术、核

7、糖体展示技术、RNA多肽融合技术和基因工程小鼠制备全人抗体等四项技术。1.3.1 噬菌体抗体库技术 该项技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。20世纪80年代Smith发现了可以分离基因的噬菌体展示技术。噬菌体展示技术建立在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白编码片段能力的基础上。这项技术的基本原理是用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因，然后将克隆的基因插入噬菌体抗体文库，从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。制备方法如下：将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体颗粒与固定的抗原结合，获取结合的抗体，将未结合的抗体洗脱，从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的

8、噬菌体颗粒去感染宿主菌，使该噬菌体颗粒得到扩增，将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体。1.3.2 核糖体展示技术 核糖体展示技术是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的技术。1994年，Mattheakis等建立了一种体外核糖体展示随机肽系统，将多肽库建立在多核糖体上，借助多核糖体在体外将基因型和表型联系起来。1997年，Hanes和Phkthun对多聚核糖体展示技术进行改进，建立了核糖体展示技术。该技术属于无细胞转化技术，不受细胞转染和表达系统的限制。其原理是利用聚合酶链反应扩增含目的基因的cDNA文库，同时引入启动子、核糖体结合位点即茎环结构，在转录/翻译偶联系统作用下，形成

9、“蛋白质核糖体mRNA”三元复合物，构成核糖体展示的抗体库，再用相应的抗原对翻译混合物进行筛选并从中分离mRNA，通过反转录聚合酶链反应富集目的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。1.3.3 RNA多肽融合技术 RNA多肽融合技术又称为mRNA展示技术或是体外病毒技术。1997年，Roberts和Szostak与Nemoto分别独立设计了这种与核糖体展示类似的方法。其原理是将抗体库中DNA转录成mRNA，含嘌呤霉素寡核苷酸的Linker将其与它所编码的肽或蛋白共价结合，形成mRNA嘌呤霉素蛋白复合物。与mRNA核糖体蛋白复合物相比，该复合物

10、更为稳定，在4可完整保存10天左右，筛选到的抗体亲和性也比较高。1.3.4 基因工程小鼠制备全人抗体 制备全人抗体的基因工程包括人外周血淋巴细胞严重联合免疫缺陷小鼠、基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。人外周血淋巴细胞严重联合免疫缺陷小鼠是将已经产生免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠，经抗原免疫后可获得人源抗体。转基因小鼠制备的基本原理是将改建后的目的基因导入小鼠的受精卵，然后将此受精卵再植入受体动物的输卵管中，使其发育成携带有外源基因的转基因小鼠，在抗原的刺激下，该转基因鼠可分泌合成人抗体。由转基因小鼠产生的McAb经历了正常的装配和成熟的过程，产生的抗

11、体具有较高的亲和力。转染色体小鼠是通过微细胞介导法将人14号染色体上产生的IgH的胚系片段和2号染色体上的550Mb的k轻链片段转染到ES细胞，获得小鼠经人血清清蛋白免疫后，可产生人血清清蛋白的人Ig，再次免疫后产生Ig。2 单克隆抗体技术的应用 单克隆抗体的应用涉及医学、农业、食品、环境等众多领域，在基础研究、蛋白纯化、环境与食品监测、疾病诊断、预防及治疗和优生优育等方面具有不可替代的作用。2.1 单克隆抗体在预防方面应用 单克隆抗体可以应用于生物免疫预防中。生物免疫预防包括主动免疫和被动免疫。在被动免疫中，为了切断母婴传播他途径，防止婴幼儿感染乙型肝炎病毒，可给围产期母亲或婴幼儿注入抗乙型

12、肝炎病毒的单抗。在主动免疫中，为了预防结核病而接种的卡介苗在体内生长繁殖，接近自然感染，可激发机体对病原的持久免疫力。2.2 单抗在临床治疗方面的应用 目前单克隆抗体可治疗包括肿瘤、免疫系统疾病及心血管疾病和变态反应等。2.3 用于肿瘤治疗的单克隆抗体 2.3.1 纯抗体治疗 随着一些关键技术的突破，针对某种肿瘤的特异性McAb进入临床实验应用的已达70多种，有些已取得了良好的疗效。2.3.2 “生物导弹”治疗 以McAb为导向的导弹可直射癌细胞靶，选择性杀伤癌细胞而对正常组织细胞损伤极小。可根据“导弹”的不同分为免疫化学疗法、免疫毒素疗法和免疫放射疗法。2.4 单克隆抗体在其他疾病中的应用

13、单克隆抗体药物不只在肿瘤的治疗中取得了很好疗效，在其他疾病的治疗中也取得了显著效果，如抗CD25McAb治疗骨髓移植术排斥反应表现良好的疗效。2.5 单克隆抗体在蛋白质提纯中的应用 单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单一克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲和层析即可从复杂的混合物中分离、纯化这一特定成分。2.6 单克隆抗体在临床诊断及检测中的应用 单抗在传染病、免疫性疾病、内分泌性疾病的诊断和早孕诊断方面，大大优于现有的抗血清，具有特异性强、灵敏度高和易标准化等优点。例如，美国Centorco公司与麻省总医院联合制备的抗

14、乙型肝炎病毒表面抗原单抗，比当前最佳抗血清敏感100倍，能从抗血清确认的阴性人群中检查出60%的漏诊带病毒者。 总之，单抗技术已深入到医学和生物学的各个领域，成为一种必不可少的工具，具有极为重要的理论研究价值和实用价值。3 展 望 从单克隆抗体技术的发展历程来看，单抗正朝着全人源化、高靶向性终生免疫和艾滋的预防与检测四个方面发展。随着人们对具有高质量和强专一性McAb需求的不断升高，抗体效应机制和免疫调节机制研究将不断深入，加之抗体制备技术的不断完善和发展，必将会有更多、更有价值的McAb服务于人类的各种需求。参考文献1刘瀛.汤仁仙.付琳琳.孔德龙，McAb制备及其表达系统的研究进展，免疫学杂

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