链霉素的生产

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1、链霉素的生产链霉素的生产灰色链霉菌的扩大培养与保藏链霉素的发酵与过程监控链霉素的分离与效价测定灰色链霉菌的扩大培养与保藏 种子扩大培养:简称种子扩培.是发酵工程的一个组成部分，其实指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。 种子扩培所得的纯种培养物称为种子。种子扩培的一般过程：斜面菌种 一级种子培养（摇瓶） 二级种子培养(种子罐) 发酵 l 种子应具备要求l 总量及浓度能满足要求。l 生理状况稳定，个体与群体区隔明显。l 活力强，移种发酵后，能够迅速生长。无杂菌污染。 l 种子扩培的目的l 接种

2、量的需要。l 菌种的训化。缩短发酵时间，保证生产水平。种子的制备工艺实验室种子制备阶段：1琼脂斜面 2 固体培养基扩大培养 3摇瓶液体培养生产种子制备阶段：种子罐扩大培养斜面孢子培养l 将砂土管（或冷冻管）保持的链霉菌孢子接种到斜面培养基，于27下培养7天。 摇瓶种子培养 待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27下培养45-48小时，待菌丝生长旺盛。 种子罐扩大培养 取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种10%于种子罐内已灭菌的培养基，通入无菌空气搅拌，在罐温27下培养62-63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温27下，发酵约7-8天。 幻

3、灯片8斜面孢子培养：将砂土管(或冷冻管)菌种接种到斜面培养基上，经培养后即得原始斜面。斜面培养基： 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚镁0.01g，琼脂20g，水1000毫升，PH7.2-7.4（配置时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中） 配制：按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000ml。趁热分装于18ml*180ml试管，斜面以8ml为宜。分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。高压蒸汽灭菌：121灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。摇瓶液体培养摇瓶种子培养基：豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，

4、硫酸铵3g，硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000ml、PH7.2-7.4。 配制：取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1Mpa下灭菌45-60min。 一、实验室种子的制备 实验室种子的制备一般采用两种方式： 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。 （1） 孢子的制备 1，细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37。细菌菌

5、体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养则需要510天。 2，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为2528。培养时间一般为414天。 3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28。培养时间为514天。 （2） 液体种子制备 1，好氧培养 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体

6、培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下： 试管三角瓶摇床种子罐 2，厌氧培养 对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下： 试管三角瓶卡式罐种子罐 例如生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培养基配制：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克琼脂与升水中）的斜面上，于4冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培养2-3天后，再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培养2天后，移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏

7、培养罐中，于15-20培养3-5天即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利与酵母菌的增殖。 二、生产车间种子制备 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 1，种子罐的作用： 主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 2，种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需

8、逐级扩大培养的次数，取决于： （1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； （2）所采用发酵罐的容积。 比如： 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27,40小时孢子发芽，产生菌丝 ）二级种子罐（27，1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 3，确定种子罐级数需注意的问题 （1） 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会 （2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 （3

9、）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。菌种的保藏l 原理：l 主要是根据菌种的生理生化特点，人工制造条件，是孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少变异。一般可以通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥或低温，使种子处于“休眠”状态，抑制繁殖能力。保藏方法l 1.斜面冰箱保藏方法 4摄氏度 36个月l 2.沙土管保藏法产 孢子或芽孢微生物 1年l 3.菌丝速冻法 甘油作保护剂，零下20摄氏度l 4.石蜡油封存法 1年左右l 5.真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般五年以上l

10、6.液氮超低温保藏法 零下196摄氏度；保护剂；保存期长 链霉素效价测定方案 试验目的： 1、设计链霉素效价测定方案 2、 熟悉并掌握抗生素效价测定方法 试验器材： 双碟 陶瓦盖 钢管、钢管放置器、玻璃容器 、毛细滴管 、灭菌刻度吸管 、称量瓶 、恒温培养箱 、万分之一天平、干燥箱、恒温水浴箱 、显微镜、抑菌圈测量仪或游标卡尺 、超净工作台 、冰箱、酒精灯、接种环 供试品称量量：50mg 缓冲液： 磷酸盐缓冲液（ph7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸氢二钾0.41g,加水使成1000ml,摇匀滤过。121蒸汽灭菌30min备用。 培养基制备数量 营养琼脂培养基：100ml,作为菌种活化用。

11、双碟数量：8套（供试品效价测定）+8套（预试验）。共16副 小钢管：32个（供试品效价测定）+32个（预试验），共64个，每个双碟操作步骤 菌种 1）枯燥芽孢杆菌【Bacillus subtilis CMCC(B) 63 501】 2）枯燥芽孢杆菌菌悬液的制备 菌液制备 取枯燥芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，加灭菌水2ml冲下菌苔，制成悬液，用吸管将此悬液接种于营养琼脂培养基上，均匀摊布，在37培养7天，取菌苔少许涂片，用革兰染色镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，65水浴内加热30min，将菌体杀死，待冷后放冰箱储藏为浓菌液。 供试品溶液的制备 供试

12、品估计效价1000000U/g.精密称取样品50.0mg，加水50ml，稀释制成1000U/ml溶液，吸取2ml加入100ml容量瓶中，加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成20U/ml溶液，吸取7ml加入100ml容量瓶中，制成1.4U/ml溶液, 吸取25ml加入50ml容量瓶中，制成0.7U/ml溶液,作为滴碟用供试品及标准品溶液。 培养基 胨5g 牛肉浸出粉3g 磷酸氢二钾3g 琼脂20g 水1000ml 除琼脂外，混合上述成分，调节ph值使比最总的ph值略高0.2，加入琼脂，加热溶化后滤过，调ph值使灭菌后为7.88.0，在115灭菌30min。 检菌为枯燥芽孢杆菌【Bacillu

13、s subtilis CMCC(B) 63 501 】 双碟的制备 预实验 将培养基用微波炉融化，保温使温度降至60左右，取8套已灭菌双碟，每套中加20ml培养基，作为底层。将另外四个装量为100ml的培养基，于58保温，30min底层凝固后，往100ml培养基中分别加入菌悬液2.0ml,1.5ml,1.0ml，0.5ml,摇匀，于每套双碟中分别加5ml,并迅速摇匀，作为菌层。30min菌层凝固后，用钢管放置器，每套双碟中放入4只小钢管。将滴好的双碟放入37恒温室中培养18h。取出双碟，将钢管倒入消毒液中，盖上玻璃盖，用效价抑菌圈测量仪测量抑菌圈大小。 高剂量和低剂量的抑菌圈直径相差大于等于2mm的为最适加菌量。 供试品 将培养基用微波炉融化，保温使温度降至60左右，取8套已灭菌双碟，每套中加20ml培养基，作为底层，另一个100ml培养基，要于58保温，30min底层凝固后，往100ml培养基中加入菌悬液1.0ml(由预试验得到)，摇匀，于每套双碟中分别加5ml,并迅速摇匀，作为菌层。30min菌层凝固后，用钢管放置器，每套双碟中放入4只小钢管。 滴碟培养 取上述供试品溶液滴入钢管内，滴加顺序为：顺时 针,SH-TH-SL-TL。将滴好的双碟放入37恒温室中培养18h。取出双碟，将钢管倒入消毒液中，盖上玻璃盖，用效价抑菌圈测量仪测量结果。