几种基因操作的工具酶

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1、一、限制性核酸内切酶及其应用（一）限制性核酸内切酶的发现当 心）噬菌体侵染E.coliB 时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列， 被降解掉。而E.coliB 的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下,催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。Eco核酸酶不能识别已甲基化的序列。最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan,大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK，是I型的，没有实用价值。首个 II 型限制内切酶是在 1970年,由 等从 Heamophilus influenzae 的 Rd菌株中H

2、ind II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出 3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。限制性核酸内切酶（restriction endon uclease ）:是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是 3，5-磷酸二 酯键。（二）限制性核酸内切酶的分类分为 I 型、 II 型和 III 型。（三）限制性核酸内切酶的命名1、 寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称,如大肠杆菌 Escherichia coli

3、 表示为 Eco , 流 感嗜血菌 Haemophilus influenzae 表示为 Hin;2、 用一个正体字母表示菌株的类型,比如EcoR、Hind;3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系,则用罗马数字标出,比如 Eco R I 、 Hin 。 d III（四）II 型限制性核酸内切酶的基本特性1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的 DNA识别位点，通常是由 48个核苷酸组成的特定序列（靶序 列）。2、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。与 II 型核酸内

4、切酶有关的几个概念粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的 单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平末端：Blunt end 在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。同裂酶： isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不 同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶： isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如 BamH I 、BclI 、BglII 和 Xho I 是一组同尾酶。注 意： 由同尾酶产生

5、的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的 粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。（五）限制性核酸内切酶的消化反应一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37C ）下， 1h 内中完全降解 1 mg l DNA 所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有： DNA的纯度 DNA 的甲基化程度 酶切反应的温度（通常为37 C ） DNA的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液在“非最适的 ”反应条件下 , 有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生 “松动”，从 其正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*

6、表示。二、DNA连接酶及其应用（一 ）DNA连接酶的发现环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。首个DNA连接酶（ligase）大肠杆菌DNA1接酶，是1967年发现的，是大肠杆菌 基因编码。1970年，发现了 T4DNA连接酶，由大肠杆菌 T4噬菌体基因编码的。（二）DNA连接酶作用特点1. 连接的两条链必须分别具有自由3 -OH和5 -P，而且这两个基团彼此相邻；2. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coli DNA 连接酶 - 连接具互补碱基黏性末端 （最初研究表明 ） ，现在研究可连接平末 端;需NAD+甫助因子，活性低，不常用。T 4DN

7、A连接酶-连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。（三）DNA连接酶的反应条件影响连接效率的因素有：1. 温度（通常在4-15 C ）2. ATP 的浓度（10 凶/L - 1mM/L ）3. 连接酶浓度（一般平末端大约需12U,黏性末端仅需 0.1U）4. 反应时间 （ 通常连接过夜 ）5. 插入片段和载体片段的摩尔比 （1 : 15 : 1）（四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1. 连接反应一般在灭菌的 0.5ml 离心管中进行。2.10 M体积反应体系中：取载体 50-100ng，加入一定比例的外源 DNA分子（一般线 性载体DNA分子与外

8、源 DNA分子摩尔数为1 : 15 : 1），补足ddH20至8 pl。3. 轻轻混匀，稍加离心，56C水浴5min后，迅速转入冰浴。4. 加入含ATP的10XBuffer 1 p , T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10 p，稍加离心，在适当温度（一般14-16 C ）连接8-14hr。三、DNA聚合酶及其应用（一）大肠杆菌DNA聚合酶I是 Kornberg A. 1956 年首先从大肠杆菌 E。 Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功 能性的酶，包括 3 种不同的酶活力：5-3聚合酶活性（模板，带3-OH游离基团的引物、4dNTPs Mg2+ ）。双链特异性的5 f 3核酸外

9、切酶活性。3 f 5核酸外切酶活性。从游离的双链或单链 DNA的3端降解。不过对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。主要是校正作用。大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途1. 利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针利用其5 -3的外切酶活性及其聚合酶活性。2. 用于DNA连接前的大缺口填充利用 5 -3 的聚合酶活性。3. 用于DNA的序列分析利用 5 -3 的聚合酶活性。（二 ）Klenow 片段酶Klenow 片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子， 分子量为 76KD 。酶催活性：5 f 3的聚合酶活性3 f 5的核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途（利

10、用5 f 3的聚合酶活性）：修补限制性酶消化 DNA形成的3隐蔽末端标记DNA片段的末端底物用a-32P-dNTPscDNA克隆中第二链cDNA的合成DNA序列的测定（三）T4 DNA聚合酶T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，1.酶催活性：5 f3 的聚合酶活性3 芦 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶I的活性高200倍。比Klenow 片段酶强1001,000倍。因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：如果反应体系中仅存在一种 dNTP或没有底物时，这时 T4DNA聚合酶就会表现出 3 5夕卜切酶活力，从双链 DNA的 3开始降解，直到露出底物 d

11、NTP相同的碱基。然后就在此 位置发生合成和取代反应。2. T4DNA聚合酶的用途(1) 利用取代合成反应制备探针(2) 标记具有平末端的或具有 3隐蔽末端的DNA片段利用较强的3 -5外切酶活性和5 专聚合活性(3) 用于DNA序列分析(四)逆转录酶 (反转录酶 )逆转录酶是一种依赖RNA的 DNA聚合酶。此酶首先是 1970 年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都 发在了同一期的 Nature 杂志上。最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)分离出来的。活性：一种可以有效地将mRN仮转录成 DNA的酶，其产物称为 cDNA(complementaryDNA).主要

12、用途是将mRNA专录成cDNA以制备基因片段。四、修饰性工具酶(一)末端转移酶 (terminal transferase)l末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。l特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或 ssDNA的在3-0耳特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。l最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。( 二 ) SI 核酸酶 (SI nuclease)这是一种从米曲霉 (Aspergillus oryzae) 中分离的高度单链特异的外切酶。活性：可以降解单链 DNA或 RNA或双链的单链区。

13、其主要用途有： 在cDNA合成过程中，切开 cDNA的发夹末端； 载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，形成平末端结构。(三 ) 碱性磷酸酶 从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶 (Bacterial Alkaline Phosphatase)简称 BAP。从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶( Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)简称CIP，用的广泛。酶催功能：脱磷酸作用，将单链或双链DNA或 RNA5P转化成5-0H。其主要用途有：在用32P标记DNA 5端之前，去除 5端的磷；在DNA重组技术中，去除 DNA片段的5磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比 例。欢迎您的下载，资料仅供参考!致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习资料等打造全网一站式需求