如何做原核表达——面面俱到Novagen产品

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1、之所以首先介绍 Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用Novagen的母公司是德国默克（Merck ）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部 位于德国的 Darmstadt，已有300多年的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。IPTG帥册討f HOST CELLfor ExpressionT7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系

2、,利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7表达系统。T7噬菌体基因编码的 T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系， 最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式噬菌体DE3是入噬菌体的衍生株，一段含

3、 有lac I, lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中,用噬菌体 DE3 的溶源菌，如 BL21(DE3) 、HMS174(DE3) 等作为表达载体的宿主菌， 调控方式为化学信号诱导型,类似于 Lac 表达系统。从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择,Novagen 公司仅提供三个载体： pET-21(+) , pET-24(+) 和 pET-23(+) 。如果你打算利 用载体的起始密码子,那么就有许多选择。根据是否要可溶性表达,选择加有不同标记的载体。一般说来在大肠杆菌中不加 标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让外源

4、蛋白融合表达一般说来有 三个策略：1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶(glutathioneS transferase, GST)、硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx )和 N 利用质 A(N utilization substance A, NusA )。2. 转入一个酶催化二硫键的形成,如：硫氧还蛋白,DsbA , DsbC。3. 插入一个定位到周质空间的信号序列。不同载体提供不同的标记,有的可以同时带有多个标记。如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以选择用 Nde I直接从起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切

5、位点把多余的多肽切除。以下是 Novagen 载体带有标记及抗性的列表：11IK?L r 1 j-i.iHftl 14bVTTTHsT-irbtIE1 lTb1UinT-rriET-?jL77厂FH1旧蛊Z-7TrllET24曲杠prhrlH25bticrr75bti丁*&* i(:p萼i M frtTFri cI EeL HE啊pMf11fETlIbtiLkt丁IT1 LEf TKTTFiIT1 TFTT111 FtpF丁|FIh t(ElT1in11|E1 3CL-t4IT1N1 EiET37htir cM11JiH iSbti丁F丁17lEYMbritlpITTIL*1C11 fit1

6、uirTHTklV| *TFpre1nr1 a旧半jj- *pT7cN1 Ek LK-TT1TTIt*ETU 沁+，N LCiT:TTUMT7/jr11 S*Tg !痕杠Tug Otb*T刼%M审T广輛目前阿比讹 rHHI1T?%时割 T7*T|MSW* 6ST*TPj 闻祐I#-IiarTi/jcT7*Iai j11ElOTagteJi-Tjy別sT料trvp*17HmT岬料*TrtTtgiPHA洛同押pipiew生物通注：带（+）指此载体利用 fl作为复制起点T7 Tagil = 11 aa fusion tag T7 Tag260 = 260 aa fusion tagsignal se

7、q. = signal sequenee for potential periplasmic localizationI = internal tag N = N-term inal tag C = opti onal C-term inal tag protease cleavage sites: T = thromb in E = en terok in ase X = Factor Xa LIC = ligati on-i ndepe ndent cloning以上载体都是采用抗生素抗性筛选，如果你希望用蓝白斑筛选可以使用pETBlue系列载体。在重组技术上，Novagen除了传统的酶切

8、、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式： Ligation-Independent cloning ，简称 LIC 。采用 LIC 方法的 pET 载体 是线性化的， 在末端有 12-15 个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。 在设计 PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列， PCR产物用3一5的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC 载体上。一般的 pET 载体是先在不含 DE3 片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21 ( DE3 )中，通过IPTG诱导进行表达。而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，

9、F 附加体上的 oriS 和 repE 元件与 parABC 共同作用 下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外 源蛋白对细胞的毒害作用。 当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导 trfA 基因表达， 质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到 25-50。 pETcoco 载体同时兼容了 DE3 调控模 型，在加入 IPTG 后诱导表达量达升高 2500 倍。在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco 的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有 T7 RNA 聚合酶抑制剂的 T7 溶菌酶表达基因的菌株中， 在含有 pLysS 的 pLysE 宿主菌内重组质粒的本底表达

10、被进一步抑制，质粒可以更稳定地存在。Novagen 提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改造，它们大致 分为以下几个种类：1. 蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包括有B834, BL21, BLR, Origami? B, Rosetta? 和 Tuner? 。因此在纯化时可以保持蛋白 的稳定不被降解。 BL21(DE3) 是应用最多的表达的表达菌株。另外它的衍生 株 BLR(DE3) 是 recA， RecA 是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。 它的缺失，可以保证质粒的稳定。2. 保证所有细胞以同样量进行表达Tuner? 株及它的衍

11、生株( Origami? B 和 Rosetta? )是 BL21 菌株的 lacY1Lac缺失突变型，在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达 渗透酶的突变使进入每个细胞的 IPTG 量都是一致的，这样使蛋白表达浓度 可以随着 IPTG 浓度而改变。 通过对 IPTG 浓度的控制可以使细胞微量表达或 者大量表达。一般说来，低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。3. 二硫键形成与溶解性增强 二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用， 而 Novagen 也专门设计 了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB ）缺陷型的，包括 AD494 ，BL21trxB

12、， Origami，Origami B 和 Rosetta-gami? 。在这 些菌株中表达蛋白，可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式 和有活性形式出现的可能增加。4. 稀有密码子的补给 不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密 码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候， 就会造成蛋白表达量极低， 或者翻译提前终止。 Rosetta? 是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大 肠杆菌稀有的密码子 tRNA ，包括 AUA ，AGG ，AGA ，CUA ，CCC 和 GGA。 它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。 Rosetta 系列是来自 BL21lacY1

13、 ，所以它 具有 BL21lacY1 的所有特性。5. 硒蛋氨酸标记B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。它在高度特异活性 35S-met 标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。我们常用的培养基有 LB 、TB 、M9 、M9ZB ，LB 因为其成本低廉所以应用最为 广泛，而 Novagen 有提供特殊的培养基 Overnight Express? Autoinduction System。使用这种培养基不需要按照传统方法先培养一段时间再加IPTG 进行诱导，它可以直接进行过夜培养。在这种培养基中含有痕量金属，可以满足合成蛋白时对金属的 需求。同时提供除了各种氨基酸，这其中蛋

14、氨酸是另外加入的。这样培养基可以满足细菌生长的各种需求， 使细菌密度更高； 可以自动诱导无需自己加 IPTG ；使蛋白 更加容易溶于培养基中；并且如果需要的话，可以对蛋氨酸进行硒标记。同时 Novagen 还有表达双外源蛋白的载体 pCDFDuet-1 DNA 、 pETDuet? -1 DNA 、pRSFDuet-1 DNA 。这些载体含有两个不同多克隆位点，可以插入两个外源 蛋白基因， 利用单独的 T7 启动子 , 乳糖操纵子和核糖体结合位点进行表达。 载体转 化进入合适的菌株中最多可以同时表达 8 个外源蛋白。Novagen 的原核表达载体可以说是一面金字招牌，有许多不同系列的载体、菌

15、株供选择；与原核表达的各种相关产品都一应俱全，比如：载体、菌株、培养基、 检测表达的抗体、纯化产品等等。原核表达的东西要说真是一天一夜都说不完，今 天就先说到这里吧。 之后还将介绍 Invitrogen 、Qiagen 等公司的各种载体及相关产品， 请继续留意。 （生物通谢菲 ）VVN 打岔： 本文部分内容来自 Novagen 的 pET 手册 一本非常值得推荐的手册， 绝非简单的介绍产品，看完后你会对整个原核表达的诸多细节有深刻的理解，着实 推荐每个已经在做表达或者即将开始做表达的同学认真学习，即使你不打算用 pET 系列，你也会获益匪浅。而且 Merck 生化小组已经将册子中文化印刷成册。我将电 子版中文手册放在新版生物通商城的表达系统的参考资料里，希望亲爱的何煜和陈文不会怒了吧，好东西值得分享哦VVN