分子试验设计

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1、分子实验设计绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达张评瑜 田晓震 绿色荧光蛋白(gree n fluoresce nt protein，GFP) 是一类存在于 包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。EGFP (Enhanced GFP即增强 型绿色荧光蛋白，它的27k Da的单体由238个氨基酸构成，本身就 是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基。其 发光过程不同于其它生物发光组织， 是不需荧光素酶参与的。在紫外 光激发下可发绿色荧光，常用作信号蛋白或报告基因。将目的基因与 EGFP基因插入载体重组表达后，可形成融合蛋白。通

2、过荧光显微镜、 共聚焦显微镜或紫外灯观察，可直接在活细胞中检测其荧光信号，简 易方便地定性检测目的基因的表达，以及进一步研究目的蛋白的定位 与动态过程。实验步骤：目的基因的获取基因表达载体的构建转化一目的基因筛选与鉴定1、首先对所给的质粒进行转化，再在大肠杆菌中扩增培养。具体转化步骤见步骤三质粒DNA的提取及琼脂糖电泳检测1.1质粒DNA的提取方法：碱裂解法原理：pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码了 EGFP蛋白，是野生型绿色荧 光蛋白(wtGFP)经技术改造而成的遗传突变体；pet原核表达质粒是 最有效的原核表达系统之一。目的基因被克隆到pET

3、质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA 聚合酶诱导。宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可 以通过IPTG来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于 表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总 蛋白的50%以上。分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质 粒扩增、收集和裂解细菌、分离和纯化质粒DNA。50mmol/L葡萄糖、 10mmol/ EDTA-Na、25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)分散细胞，其中螯合 金属离子使酶失活，防止 DNA的降解；0.4mol/L NaOH和2% SDS

4、临用前1:1配制，使细胞裂解，蛋白质与染色体DNA发生变性；60ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml双蒸水 使DNA在酸性条件下复性，留 在上清液，大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。实验用品：仪器：恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、 100、1000 Z微量移液器各一支，台式高速离心机，制冰机，混合漩 涡器。1.1.4.2 材料： 含质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3 菌液、.5ml 塑 料离心管、EP管架、微量取液器和取液器吸头、常用玻璃器皿（如 三角瓶、量筒、试剂瓶）等1.143试剂：LB培养液：胰蛋白胨（Tryptone）10g,酵母

5、提取物（Yeast extract ）5 g，NaCI 5g，琼脂（固体培养基）15g, 用 1N NaOH调 pH 7.5。溶液 I: 50mmol/L 葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na 25mmol/L Tris-HCI （pH8.0）;溶液 II: 0.4moI/L NaOH , 2% SDS，临用前 1: 1 配制; 溶液皿：5moI/L醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml ;卡纳霉素（50mg/mL）;抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25: 24: 1 ）;无水乙醇；70%L醇；TE缓冲液或ddH2O步骤：将含pET- 28a质粒的大肠杆菌，含pEGFP-N；质

6、粒的大肠杆菌 分别接种在液体培养基中（加卡那霉素 50卩g/mL）, 37C培养过夜。1.1.5.2 取培养菌液1.5mL置Eppendof小管中，10000rpm离心 2min,弃上清液。1.1.5.3 加入100卩L溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10mi n。加入200卩L新配制的溶液I,轻轻翻转 23次，使之混匀， 冰上放置5 min。加入150卩L冰冷的溶液皿，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置 15 min 。离心5 min，取上清液于另一干净的离心管中。向上清液中加入等体积（约400卩L）酚：氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，lOOOO

7、rpm离心10 min，将上清液转移至新 的离心管中。加入等体积（约370卩L）氯仿/异戊醇（24:1 ）,混匀，离心 2min ,取上清液于新离心管中。1.1.5.9 向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20 C放置1h。1.1.5.10 12000rpm离心5 min,倒去上清液，把离心管倒扣在吸水 纸上，吸干液体。力口 800卩L70临醇，12000rpm离心1 min，倒尽上清液， 室温自然干燥30min。力口 30 卩 L ddH20 , -20 C保存备用。注意事项：）饱和酚（取下层）单独吸200 uL氯仿：异戊醇（24: 1） 吸 200 uL制备质粒过程中，所有操作必须缓和，

8、不要剧烈振荡（特 别是加入溶液II和III ）,以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。在取各种试剂的过程中，一定注意移液器吸头的更换， 避免污染。1.2琼脂糖电泳检测方法：琼脂糖电泳原理：DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为 200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之 间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段， 选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 在质粒提取的过程中，由 于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性 DNA、开环DNA、闭 环超螺旋DNA。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速 度：闭环超螺旋线状开环。但有时也有也会

9、出现相反情况，因为 与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。实验用品：123.1 材料和仪器电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，微波炉，水 平仪，10、100、1000卩L微量取液器各一支，凝胶成像系统，提取 的pET- 28a和pEGFP-N3质粒，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲, 封口膜，剪刀，取液器吸头。试齐IGold view （DNA染料）；0.5 x TBE缓冲液：Tris 10.88g、硼酸 5.52g、 EDTA Na2- 2H2O 0.74g,定容至200ml，使用时稀释10倍；6x上 样缓冲液：溴酚蓝0.25 %、蔗糖40% DNA marker

10、。步骤:1.241琼脂糖凝胶板的制备称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL0.5X TBE缓冲液，微波 炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却到65C（不烫手为宜），加入1卩L Gold view 混匀，排 除气泡,缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳 子）内。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。力叶羊胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入0.5 X TBE缓冲液淹没过 胶板5mm用取液器将提取的质粒 DNAW L与1卩L6X上样缓冲液混 匀，加入胶板的样品小槽内。1.2.4.3 电泳将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为 100 V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿

11、约12cm处，停止电泳。1.244观察和拍照将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中 DNA存在处显示出荧光条带。实验结果预测：正常情况下会出现两条条带（闭环和开环 质粒）。二、基因表达载体的构建1、DNA限制性内切酶酶切1.1方法：DNA限制性酶切1.2原理：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。pet原核表达质粒是最有效的原核表达系统之 一。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体 T7强转录及翻 译信号控制；表达由宿主细胞提供的 T7RNA聚合

12、酶诱导。宿主菌带 有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。 充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白； 诱导表达后 仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50%以上。Ww M1Hi| 电kwHliid Mlrmi Mlini &K I IKII EcRBimH H1Mi NM hHrtiNurknci耳 bo k m|l|40fl|SflfA Ij442|- Sptl l；5H|酶切位点:BamHINotlMki百切BitE Ibg.pET-28a(+JjSWbpi曲pLLH 1 13Z94 -Sapco01091A/raL I015Ase I|B

13、* S/wB ICMVMCS1531-465)4 SV TIC poly APEGFP-N34.7 kbSVpoly A二 Not I 1398tXba I* (1408)BaJl iDT LJWfii-r llli111 h7H：iStu II(2S75IAftll (16361Dra IIJ tia?o)MSOItilHI削側叭帥曲 测icWG加脚CTCAih师脚血CTK6 山 ItMGT淞 ffilMcSMCCCGIiklMTCG 池（:崗 删脚III蹣II *1 :-Ml fill釧 伽l舰厂巾涮I市I無Ltai师1計刚I X/ua帥奸kll血I1.3实验用品：材料：实验一提取的质粒

14、pEGFP-N3和pET-28a , 0.2mlEP管,取液器吸头，一次性手套试剂：Not I, Bam HI, ddHzO, 10buffer，琼脂糖,Gold view设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱1.4步骤：分别去两支0.2mlEP管做上记号：如两个EP管中分别配置下列的30卩体系：号管号管BSA3 a l3 a l10xBuffer3 a l3 a lNot I2 a l2 a lBam HI2 a l2 a l质粒pET -28a 20 a lpEGFP-T1 20 a l将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱 37C酶切3h取5卩L EP管

15、的酶切反应液，同时取5原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段 2、连接重组2.1方法：DNA连接重组2.2原理:连接的DNA分子具备的条件：具有相同粘性末端（同种酶切 的片段）的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容 易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构。连接反应温度：理论上讲，连接反应的最佳温度是37C，此时连接酶的活性最高。但37C粘性末端分子形成的配对结构极不稳定， 因此，人们找到了一个最适温度，即1216C。此时既可最大限度地 发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。本实验选择16C。2.3实验用品：材料：酶切后的EGF

16、P和pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸头,一次性手套2.3.2 试剂：T4DNA 连接酶，ddHzO, T4DNA 连接酶 buffer设备：移液器，台式高速离心机，PCR仪2.4步骤： 在EP管中分别配置下列的体系:0.2mlEP 管10xbuffer2卩l酶切后的pET -28aXa l没切后的EGFP片段丫卩lT4DNA连接酶2 a lX : Y二1 : 310,用水补足20 L。24 EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱 16C反应过夜后， -20C下保存用于转化。3. 重组DNA的转化及重组子的鉴定3.1重组DNA分子的转化方法：热转化法原理：细菌处于容易吸收外源 DNA的

17、生理状态叫感受态。 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的 过程。其原理是细菌处于00C，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细 胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸 复合物粘附于细胞表面，经42C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA 复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过 程中获得的新的表型（在本实验中为卡那霉素抗性）得到表达。在含 Kana的选择性培养基上进行重组子的鉴定E.coli EH5 a是一种常用于质粒克隆的菌株，可以使质粒高拷贝数扩增，获得大量的质粒实验用品341 材料：重组质粒 pET-28a-EGFP, E

18、.coli DH a 5用品：摇床，玻璃涂布器步骤取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每200 L 解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30mi n3.1.5.2 420C热冲击60秒，立即置于冰浴5min。再在感受态细胞混合物中加入 0.8mL的LB培养基，于 37C摇床中培养1h。3.1.5.4 1h 后，6000r/min 离心 3min，去掉上清（约留 200 L 的培养液），摇匀菌块。用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含 Kana的LB固体培 养基上，正置培养皿半小时后，370C培养箱中倒置培养皿过夜。第二天早上观察结果。结果预测由于转入的pET-28a质粒含有卡那霉素的抗性

19、基因，所以能够在含有Kana的培养基上面生长培养基上长出正常的菌落，表示质粒转入成功培养基上形成小菌落，转入的质粒只一直沿着单个细胞 遗传下去3.2重组子的鉴定由于质粒pET-28a和质粒pEGFP-N3相同的酶切位点为BamH I和NotI，两个酶切位点之间并无标记基因，所以即使在选择培养基上表达为阳性，也可能说明转入的为pET-28a质粒，并不能完全确定 为重组质粒，所以需进行重组子的检测原理：利用PCR和双酶切的方法对重组子进行鉴定PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性一退火一延伸三个步骤组成：高温变性-94 C下DNA双链解旋为单链；低温退火-55 C左右时

20、，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合温延伸-72 C时，Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按5宀方向，复制模板的互补链。按此循环（变性一复性一延伸），一般重2530次，短时间 内，使目的基因片段扩增2n （n代表循环次数）。实验材料3.2.1.2 材料DNA模板，4XdNTP,T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，MarkerDNA，吸头试齐I10 buffer, 15 mmol/L MgCI2PCR热循环仪， 琼脂糖凝胶电泳系统322双酶切原理：由于质粒的黏性末端是Not I, Bam HI,两种限制性内切酶切割产生的，载体和目的基因的粘性末端互补配对形成重 组质粒，所以在重组质

21、粒上也存在Not I, Bam HI的酶切位点，在阳性克隆的细菌中提取质粒，双酶切过后对酶切后的产物检验，可以验证是重组质粒是否转化成功。实验材料试剂 Not I, Bam HI, lOWuffer,设备移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统， 凝胶成像系统322.2步骤取一只 0.2ml 的 EP 管管中配置下列的体系EP管BSA10 x bufferNot I3卩L2卩L2卩LBam HI重组质粒20卩L32223将EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱 37C酶切3h。32224取5卩LEP管的酶切反应液，同时取5L目的基因溶液 作对照，进行电泳检测酶切结果。32223结果预测32223.1

22、酶切产物中只出现一条带，证明重组质粒转入成功 32223.2酶切产物没有出现条带，证明转化失败3.3减小误差方案由于是直接从平板中挑去菌落，转化后的细菌 细胞壁外会附着一些阳性克隆。所以可能会导致PCR结果成阳性，在实验当中应该避免这一点，方法可以有挑取单克隆菌落后在10ul的双蒸水或没有核酸酶的水中吹打几下，再取2ul作模版3.4对根据电泳的结果对阳性质粒导入车成功的菌落进行扩增培 养，使重组质粒得到大量的拷贝。4. 重组子的表达4.1原理：BL21(DE3)菌株该菌株用于高效表达克隆于含有 噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA 聚合酶位于入噬菌体DE3区，该区

23、整合于BL21的染色体上。该菌 适合表达非毒性蛋白。4.2实验材料E.coliBL21，重组质粒422设备：LB培养基，荧光显微镜4.3步骤步骤取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻，每200 口1解冻的感受态细胞加入5卩L pET28a-EGFP质粒，混匀后冰浴30mi n4.3242C热冲击90秒，立即置于冰浴5min。再将感受态细胞混合物转入 0.8mL的LB培养基，于 370C摇床中培养1h。期间将200 勺24mg/ml IPTG涂布在含Kana 的LB培养基上，待用。后，6000r/min 离心 5min,去掉上清（约留 200 的培养液），摇匀菌块。用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB 固体培养基上，正置培养皿半小时后，37C培养箱中倒置培养皿过 夜。第二天早上观察结果。4.4实验结果若观察到绿色荧光表明实验成功，若无绿色荧光则说明实验失 败参考文献【1】Lentivirus介导表达多基因的人胚基因工程神经干细胞实验研究程刚吴兆翔杨华刚马志簪【2】 高产氨基葡萄糖基因工程菌的研究进展【3】 抗菌肽CM基因克隆及其在毕赤酵母中的表达鉴定【4】 嗜热子囊菌光孢变种cbhl基因的cDNA克隆及在毕赤 酵母的高效表达【5】细菌质粒与基因工程