真菌检测步骤

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1、真菌检查步骤1 .采集标本 浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、 脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本时应注意无菌操作。2 .检查方法 真菌检查的方法主要有：(1)直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。取标本置玻片上，加一滴 10%KOH 溶液, 盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热，待标本溶解，轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。可用于检查有无菌丝或抱子，但不能确定菌种。(2)墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的抱子。医学教育|网搜集整理方法是取一小滴墨汁与标本(如脑脊液)混合，盖上盖

2、玻片后直接镜检。(3)涂片或组织切片染色：涂片染色可更好地显示真菌形态和结构。革兰染色适用于白念珠菌、抱子丝菌等；瑞氏染色适用于组织胞浆菌；组织切片通常用PAS染色，多数真菌可被染成红色。(4)培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白月东琼脂培养基上，置室温或37 C培养13周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌 落的形态及显微镜下形态判断，对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、 分子生物学方法确定。四、真菌学检验的基本技术（1） 直接镜检是最简单也是最有用的实验室诊断方法，常用的方法有：氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖

3、上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过 23次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或 吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌 丝和抱子，然后用高倍镜观察抱子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。浮载液： A.10%20%勺KOH配方：氢氧化钾1020g,蒸储水加至100ml,待氢氧化钾完全溶解后摇 匀存放在塑料瓶内，适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、痰、粪便、组织、町监等的检查。B.复方氢氧化钾溶液配方：氢氧化钾(AR) 10g,二甲基亚碉(AR) 40ml,甘油50ml,蒸储水加至100ml,配制方法：将氢氧化钾

4、先加入 30ml蒸储水中溶解后，再依次加入 DMSO甘 油摇匀后，用蒸储水加到 100ml,装入塑料瓶内。此配方的优点是：配方中加 DMSO能促 进角质的溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氢氧化钾结晶，氢氧化钾的浓度相对低，腐 蚀性亦低，为进行大面积普查或大批量采集标本作镜检带来了方便。胶纸粘贴法：用 1cmx 1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带在上面的底 板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫 染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则 影响观察。涂片染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐

5、水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择适当的染色方法，染色后，以高倍镜 或油镜观察。常见镜检染色方法有：革兰染色。所有真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。适用于酵母菌、抱子丝菌、组织抱浆菌及诺卡菌、放线菌的感染。乳酸酚棉蓝染色：用 于各种真菌培养物的镜检。印度墨汁：用于检测脑脊液（ CSF中的新生隐球菌。抗酸 染色：用于抗酸菌及诺卡菌的诊断。瑞氏染色：用于组织胞浆菌和马内菲青霉的检测。过碘酸锡夫染色（PAS：用于体液渗出液和组织匀浆等。真菌胞壁中的多糖染色后呈红 色，细菌和中性细胞偶可呈假阳性，但与真菌结构不同，不难区别。嗜银染色（GM$:真菌可染成

6、黑色，主要用于测定组织内真菌。（2） 真菌培养从临床标本中对致病真菌进行培养，目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率，以弥 补直接镜检的不足，同时确定致病菌的种类。真菌培养检查除需要一般细菌检验用到的器 具外，还应准备真菌专用的接种针、接种环、或接种钩（用钳丝或馍丝制成）、微型小铲、刀片、针头等，常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂（ SDA斜面培养基，加 0.05%氯霉素，还有多种性质的培养基（见第二部分）以满足各种不同的需要，可酌情选用 接种的方法，根据不同的临床标本，大体可分为点植法和划线法两种。点植法：适用于 皮屑、甲屑、毛发、痂皮、组织等有形固体标本，将标本直接与培养基表面点状

7、接触。 划线法：适用于痰、分泌物、脓液、组织液、组织块的研磨液等液体标本，用接种针（环） 划线接种在培养基表面。培养方法有多种，接临床标本接种时间分为直接培养法和间接培养法；按培养方法分为试 管法、平皿法（大培养）和玻片法（小培养）。直接培养：采集标本后直接接种于培养基上。间接培养：采集标本后，暂保存，以后集中接种。试管培养：是临床上最常用 的培养方法之一，培养基置于试管中，主要用于临床标本分离的初代培养和菌种保存。 大培养：将培养物接种在培养皿或特别的培养瓶内，主要用于纯菌种的培养和研究。小 培养：主要用于菌种鉴定，大致分为三种：玻片法，方块法和钢圈法。A.玻片法：在消毒的载玻片上，均匀地浇

8、上熔化的培养基，不宜太厚。凝固后接种待鉴定菌株，置于平皿中， 保湿。待有生长后，盖上消毒的盖玻片，显微镜下直接观察，常用米粉吐温琼脂培养基观 察白念珠菌的顶端厚壁抱子和假菌丝。B.方块法：适用于霉菌菌落的培养。取无菌平皿倒入Z1 15ml熔化的培养基，待凝固后用无菌小铲或接种刀划成1cm2大小的小块。取一小块移在无菌载玻片上，然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株，盖上消毒的盖玻片，放 入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，并加入少量无菌蒸储水，孵育，待菌落 生长后直接将载玻片置显微镜下观察。C.钢圈法：先将固体石蜡加热熔化，取直径约2cm,厚度约0.5cm有孔口的不锈钢小钢圈，火焰消毒

9、后趁热浸入石蜡油，旋即取出冷却，石蜡 油即附着于小钢圈中。再取一无菌载玻片，火焰上稍加热，将小钢圈平置其上，孔口向上。 小钢圈上石蜡油遇载玻片的热即熔化后凝固，钢圈就会固定在载玻片上。用无菌注射器经 孔口注入熔化的培养基，培养基量约占小钢圈容量的1/2,注意避免气泡。待培养基凝固后取一消毒盖玻片，火焰上加热后，趁热盖在小钢圈表面，也即固定其上。最后用接种针伸 入孔口进行接种。这种方法的优点是形成一种封闭式培养，在显微镜下直接观察菌落时可 避免抱子吸入人体，而且不易被污染，盖玻片也可取下染色后封固制片保存。（3）培养检查标本接种后，每周至少检查 2次，观察以下指标：菌落外观：A.生长速度：缓慢生

10、长菌：714d,快速生长菌：27d。一般浅部真菌超过 2周深部真菌超过4周仍无生长，可报告 阴性。B.外观：a.扁平。b.疣状。c.折叠规则或不规则。d.缠结或垫状。e.其他。C.大小： 菌落大小用cm来表示，菌落大小与生长速度和培养时间有关。D.质地：a.平滑状。b.粉状。c.粒状。d.棉花状。e.粗毛斗大。f.皮革状。g.粘液状。h.膜状。E.1B色：不同的菌种表现 出不同的颜色，呈鲜艳或暗淡。致病性真菌的颜色多较淡，呈白色或淡黄色，而且其培养基也可变色，如马尔尼菲青霉等，有些真菌菌落不但正面有1g色，其背面也有深浅不同的 颜色。菌落的颜色与培养基的种类、培养温度、培养时间、移种代数等因素

11、有关。所以， 菌落的颜色虽在菌种鉴定上有重要的参考价值，但除少数菌种外，一般不作为鉴定的重要 依据。F.菌落的边缘：有些菌落的边缘整齐，有些不整齐。G.菌落的高度和下沉现象：有些菌落下沉现象明显，如黄癣菌、絮状表皮癣菌等，更有甚者菌落有时为之裂开。H.渗出物：一些真菌如青霉、曲霉的菌落表面会出现液滴。I.变异：有些真菌的菌落日久或多次传代培养而发生变异，菌落颜色减退或消失，表面气生菌丝增多，如絮状表皮癣菌在23周后便发生变异。显微镜检查：小培养可置普通显微镜下直接观察，而试管和平皿培养 的菌落则需挑起后做涂片检查。五、组织病理学检查真菌病的组织病理检查与直接镜检培养同样具有相当重要的价值，尤其

12、对深部真菌病的诊 断意义更大，如用特殊染色可提高阳性率。真菌的组织病理反应与其他一些疾病的组织病理反应极其相似，往往只有在仔细研究了病 理切片并发现了真菌之后才考虑到真菌病的诊断。而在这种情况下，标本已被固定，培养 有时已不可能进行，组织病理切片就成了真菌感染的主要依据。所以临床上在送病理标本 的同时，要尽可能考虑到真菌感染的可能，以便同时采集标本送真菌实验室进行真菌学检 查。真菌在组织内一般表现为：抱子：酵母和双相型真菌在组织内表现为抱子。菌丝：许 多真菌在组织中只表现为菌丝。组织中发现无色分隔、分支的菌丝多为念珠菌和曲霉。粗 大、不分隔少分支的菌丝为接合菌，多为毛霉、根霉、犁头霉等。粗大、

13、少分支有隔的菌 丝为蛙粪霉菌。棕色菌丝为暗色丝抱霉病，由暗色抱科真菌引起。菌丝和抱子，主要见 于念珠菌感染。颗粒：为组织内由菌丝形成的团块。球囊或内抱囊：球囊内含有内抱 子，为球抱子菌或鼻泡子菌在组织内的特征性结构。组织病理片中根据形态和染色能基本确定种名的真菌为：荚膜组织胞浆菌、杜波伊斯组织 胞浆菌、副球抱子菌、皮炎芽生菌、链状芽生菌、粗球抱子菌、新生隐球菌和鼻泡子菌等。 根据组织病理中真菌的形态能确定属而不能确定种的病为：放线菌病、奴卡菌病、无绿藻 病、念珠菌病、曲霉病和不育大抱子菌病等。多个属的真菌感染可引起相同的临床表现， 在组织病理中真菌的形态无法区别的病有皮肤着生芽生菌病、暗色丝抱

14、霉病、接合菌病、 皮肤癣菌病和足菌肿等。足菌肿的颗粒若染色适当，很易确定为放线菌性或真菌性的，也 能区别出细菌性颗粒。真菌性颗粒中的菌丝又分为无色或暗色两大类。各种病原菌基本上 形成各自颜色、大小、形成和结构的颗粒，可以初步区别，但最后确定必须依靠真菌培养。六、血清学方法随着诊断技术的进展，以免疫学方法检测真菌病已成为可能，引起深部真菌感染的病原菌 主要有白念珠菌、曲霉菌和隐球菌等，传统的检测方法主要为血培养和组织活检，但血培 养历时太长，且深部真菌感染的病原菌常不易培养成功，阳性率较低。而深部真菌感染的 临床征象错综复杂，又使得组织活检缺乏典型改变，影响正确诊断，这些都使得这些方法 所起的作

15、用极为有限，真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查用于深部真菌感染的实 验室检测，可取得很好的效果。目前常用的免疫诊断方法有：特异性抗原的检测：A.乳胶凝集t验（LA）。B.酶联免疫试验（EIA）。C.荧光免疫测定法（FA）o特异性抗体检 测：由于受检者都为免疫低下患者，因其致阳性率低，故现已少用。七、分子生物学方法近年来随着分子生物学的发展，已有聚合酶链反应（ PCR扩增、分子探针、限制性酶切片 段长度多态性分析（RFLB、DNA旨纹图谱、随机扩增 DN够态，fIe （ RAPD等方法。用于深 部真菌病的诊断和分型研究，形成了以PCR术为基础的一系列分子诊断方法。从这些新技术对多种致病真菌鉴定的应用过程中发现，此类方法具有操作简便、省时省力、特异性、 敏感性高的优点。特别是从分子水平对真菌从遗传进化角度阐明菌种间内在的分类学关系， 真正达到人们追求已久的自然分类的目的。我们有理由相信，随着PCR及相关技术在临床的应用及更广泛深入的研究，将会对真菌感染的诊断和鉴定产生根本的影响。