WesternBlot内参选择

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1、Western Blot 内参选择要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是 Western Blot 。因为 Western Blot 操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可 以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候 Western Blot 做起来很简单， 可不顺的时候也很令人心烦做不出 结果啦、 假阳性啦、 结果出现多条带啦、 到底是一抗有问题还是二抗有问题啦 , 毕竟， 作 为一种有活性的生物大分子， 抗体和抗原的反应不象 1+1 那么明确， 而用这种不确定的试剂 来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的 We

2、stern Blot 实验设计中要求有良好的参照体系， 对实验结果分析是非常有用。 特别是当实验出现问题时， 借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量 Marker （用来确定蛋白条带对应的分子量大小） 、空白 载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照） 、已知量标准产物的正对照，另外 还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因， 国内的不少人做 Western Blot 往往省略参照， 导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。内参即是内部参照 （ Internal Control ），对于哺乳动物细胞表达来说一般

3、是指由管家基因 编码表达的蛋白 （Housekeeping Proteins） ，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定， 在检测蛋 白的表达水平变化时常用它来做参照物。在 Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽 提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行 内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。实际上内参是最容易被忽略的一项。 我们知道， 要用 Western Blot 比较不同条件下或者 不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础， 特别表达量不高时， 上样量的

4、差别就很可能影响结果的分析， 所以需要内参。 在国外发表的 文章中， Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少 科研人员在 Western Blotting 实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比 较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法， 都存在局限性， 不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓 度。如 UV 法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操 作简单，但是容易受到平行物质如 DNA 的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色 法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、

5、 Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。 Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry、 BCA 反应的还原剂（如DTT,巯基乙醇）相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同 的标准品会导致同一样品的结果差异较大， 无可比性。 另外， 蛋白质定量以后进行电泳时需 要等量上样，此步骤也存在操作误差。在 Western blotting 实验时使用内参，即可简便地对 定量和上样步骤产生的误差进行校正。在 Western Blotting 中使用内参其实就是 在 WB 过程中另外用内参对应的抗体检测内参 ， 这样在检测目的产物的同时可

6、以检测内参的表达， 由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒 定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。 此外使用内参可以作为空白对照， 检测蛋白转膜情况是否完全、 整个 Western Blot 显色或者 发光体系是否正常。在 Western Blotting 实验过程中使用内参的方法通常有以下三种。第一种是超级简便的标记内参使用法，只要在二抗孵育时加入HRP 标记内参抗体，按照正常操作即可；第二种是普通内参， 当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可 以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测，然后使用 Strip 缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进

7、 行内参蛋白的抗体温育、显色检测。第三种，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下， 可以在转膜后预染，根据蛋白质 Marker 的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内 参蛋白与目的蛋白分开， 然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育， 二抗 温育以及显色。常用的蛋白质内参有GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和细胞骨架蛋白 beta-actin 或 beta-tubulin 。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差 5KD 以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参

8、！actin 即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。 actin 大致可分为六种，其中四种是不 同肌肉组 织特 异性的 ，包括 alpha-skeletal muscle actin 、alpha-cardiac muscle actin 、 alpha-smooth muscle actin 和 gamma-smooth muscle actin ，其余两种广泛分布于各种组织中， 包括 beta-actin( 3 - non-muscle)禾口 gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一 样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha

9、-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论 的。 beta-actin 作为内参是得到了公 认的， 这是针对大多数组织和细胞来说的， 它广泛分布于细胞浆内， 表达量非常丰富。 尽管 最近有一些文章已经开始质疑 beta-actin 作为内参的有效性(好像是对于上样量 20ug 的蛋 白区分能力下降，记不清楚了) ，但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可 以考虑用的，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似， 是细胞骨架的组成部分， 但是不是肌肉的主要成分， 应该是一个代替品。

10、 三种同时发 生变化的情况很少， 需要具体分析。 一旦出现上述三种内参同时发生变化， 如果是总蛋白可 以用胞核的内参如PCNA TATA-box bingding protein(TBP)甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白， 很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。 很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的， 不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C端。选用 N-端 Ac-Asp-Asp-Asp-lle-Ala-Ala-Leu-Val-ll

11、e-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys16aa 作为抗 原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santacruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)， ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967), Axxora PLATFORM(BET-A30(等，这类抗体均不能 检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用 C端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777)EPITOMICS(1784-1,1854-1等),这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。 有时候在实

12、验中检测内参时产生 “组织特异性” ，就是由于抗体选择不对造成的。actin 几种异构体存在组织分布特异性， 不同型 actin 之间具有较高的序列相似性(90%)。3 -actin 是分布于非肌细胞中的一种骨架蛋白，选择作 3 -actin 内参时首先得保证是组织广 泛表达的(尤其是做蛋白的组织表达谱时) 。那么制备 3 -actin 抗体的抗原应该是选用与 actin 其它异构体一致的氨基酸序列。 公司制备抗体是选用 beta-actin 的某一段小短肽作为免疫原， 可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否，而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如选取的短肽仅在 beta型存在,所得抗体就仅能检测非肌细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在 ,则此抗体除非肌细胞外 ,还可以检测 cardiac， skeletal， smooth muscle 细胞的 actin 。