09级细胞生物学技术

《09级细胞生物学技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《09级细胞生物学技术（12页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、1细胞培养的概念？习惯上泛指所有的体外培养，即器官培养，组织培养，和细胞培养的总称。 在无菌条件下,从动物(植物也可)或在人体中取出组织或细胞,置于模拟体内的生理环境中(无菌,适当的温度和一定的营养条件)使之生存和增殖生长的技术方法。用于研究细胞、组织的代谢、增殖、分化、形态和功能变化，各种理化因子对活细胞的影响。2体外细胞的分化特点？细胞分化：在个体发育过程中，子代细胞产生形态、结构和功能差异的过程。（细胞的形态结构、生化特征、生理功能为细胞分化的三项指标），由于体外培养细胞失去了神经、激素等体液的调节和细胞间相互影响，经多次传代增殖，久之则发生如下变化:分化现象逐渐减弱或不显，形态与功能趋

2、于单一化，或传一定代数后衰老死亡；发生转化，获不死性而成为能无限传代的连续细胞系或恶性细胞系。 3体外培养细胞的分型 ？并说明各自的形态特点?分型:1 贴壁型细胞(上皮细胞型,成纤维细胞型,游走细胞型) 2悬浮型细胞. 形态特点1.上皮样细胞型:仅形态上似体内上皮细胞，实际上不完全等于体内同名的细胞。来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 ；消化道，乳腺，肺泡 ；上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞。扁平，不规则多角形，中有圆形核。生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺路石状。生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。2.成纤维样细胞型名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的细胞

3、来源：由中胚层间质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞；心肌，平滑肌，成骨细胞形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出23个长短不等的突起中有卵圆形核.生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而单独行动,游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起.3.游走型细胞(不定型)：本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则.常见于羊水细胞培养的早期.4悬浮生长型细胞概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长.来源:来自血，脾或骨髓，尤以血中白细 胞多见

4、，癌肿细胞也可能。特点：在悬浮液中生长良好、细胞圆形，单个或小细胞团。优点：生存空间大，提供数量大， 传代方便(不需消化) 易于收获可获得稳定状态.缺点：观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)4那些培养条件改变时，细胞形态可有变化？（见表一）组织和细胞供体年龄。培养条件。细胞的粘附。培养技术方法。促生长因子。组织和细胞供体年龄：幼年个体比老年者易于培养，所有动物的胚胎组织都是最好的培养对象。来自同一个体的组织，分化低的比分化高的容易培养。培养条件：不同的细胞对培养基需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。应了解所培养细胞的生物学形状和特殊需求成分。血清，Hela：高

5、血清成纤维细胞样低血清上皮样细胞。pH，Hela：太酸或太碱，成纤维细胞样；标准pH，上皮样细胞。细胞密度 3T3：低密度，成纤维细胞样，高密度，上皮样细胞。生长状态改变：悬浮或贴附：悬浮时圆形 ，贴附成纤维或上皮样。转化与否：未转化，成纤维样，转化后，可成上皮样。 5简述每代贴附生长细胞的生长过程分哪几期？游离期 ： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟4小时贴壁。潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研

6、究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。（接触抑制：当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞的表面相互接触时，便停止了分裂增殖，相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不进入S期。密度抑制（density inhibition）：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象。 6影响贴壁的因素和促进细胞粘附措施有哪些？1因素：（1）各种细胞强弱： (附着最强)巨噬细胞、成纤维细胞；上皮细胞、血细胞(最弱)。（2）生物因素：血清、培养液中的促附着因子。（3）机械，物理等因素（离心：促进附着。流动：培养液流动可阻止细胞附着。低温：可抑制附着）2措

7、施：（1）包被：对分化程度高、生长能力差的细胞，可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和生长的生物活性物质. 血清内含有多种能够促进细胞粘附的成分，细胞本身也可能产生一些粘附分子。（2）减少接种时培养液的量：待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液。（3）减少培养液中血清的含量，使培养液黏度降低。（4）培养液中离子成分及其浓度。如，培养液中的Ca2+含量过低时不利于细胞的粘附、贴壁和铺展。（5）培养液的温度: 低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁 。7原代培养的概念：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养 。原代培养与体内原组织很相似，具异质性，相互依存性强，细胞克隆形成

8、率低。此期一般持续14周。8简述体外培养细胞的分期？原代培养期:取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养 原代培养与体内原组织很相似，具异质性，相互依存性强，细胞克隆形成率低。此期一般持续14周。传代期:细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中（不论稀释与否）。持续时间最长，其特 点是细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。衰退期:此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。9举例说明细胞生长曲线的制作方法？计算细胞浓度2次，得出细胞浓度平均值。然后，将细胞悬液等量加入培养板的每个孔中，培养时间7天。每隔24小时吸去3个孔的培养板，

9、加入消化液，混悬细胞，计算细胞数目。每个孔计数2次，得出细胞浓度平均值。绘制细胞生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度。10. 体外培养细胞生长的条件（1） 细胞的营养需要：氨基酸、单糖、维生素、无机离 子、微量元素、激素、生长因子等。（2） 细胞的生存环境：温度: 37 、O2 、CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-、pH: 7.2-7.4、渗透压。（3） 无污染。 （4） 无毒11. 选择血清需注意事项有哪些？注意事项：血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清（剖腹产）、新生牛血清（小于24h）、小牛血清（1030D）、兔血清、马血清等，其中以胎

10、牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟。血清的消毒：过滤除菌一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。12. 简述完全培养基的组成及配制方法?组成：基础培养基80一95血清 5一20碳酸氢钠2.0 g/L青、链霉素 各100单位毫升.

11、配制方法:认真阅读说明书配制时要保证充分溶解，各种物质要在培养基完全溶解后添加配制水应为双蒸水或三蒸水所用器皿应十分清洁配制好后马上过滤，低温无菌保存。13.什么时候需要进行过滤除菌？简述过滤除菌的全过程？将液体或气体用微孔虑膜过滤,使大于孔径的的细菌等微生物颗粒阻留,达到除菌的目的. 常用于不易高压灭菌的物品。如：培养液、各种酶类等。14.细胞培养实验中，使用过的玻璃和塑料制品应如何处理后重复使用？1. 常用玻璃器皿清洗：浸泡（自来水）-刷洗（洗洁精）-酸泡5盐酸过夜（不少于6小时）-流水冲洗-蒸溜水浸泡和冲洗（注满水倒空）-50烘干-121高压蒸汽灭菌20min2. 塑料制品的清洗： 料自

12、制品现多是采用无毒并已经特殊处理的成品，打开包装即可用,多为一次性物品。必要时用：2% NaOH浸泡过夜-自来水充分冲洗 ，清洁液洗刷 5%盐酸溶液浸泡30分钟-自来水和蒸馏水冲洗（1520遍）-晾干备用 ,紫外线直接照射或辐照灭菌15无菌操作的注意事项？1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染16. 分

13、别指出下列物品通常使用那种消毒方法进行消毒？（培养室、工作台、，玻璃制品、，金属器械、，塑料制品，橡胶制品，培养用液、，布类）.消毒方法分为三类： （A） 物理灭菌法（紫外线、湿热、过滤等）。 （B） 化学灭菌法（各种化学消毒剂）。 （ C） 抗生素。1. 紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器 。紫外线灯应距地面 已2.0米为宜，且消毒的物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。时间30分钟。2. 温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。常用物品消毒压力及时间：培养液、橡胶制品10磅10分钟；布类、玻璃制品、金属器械18磅20分钟。3.

14、 过滤消毒：将液体或气体用微孔虑膜过滤,使大于孔径的的细菌等微生物颗粒阻留,达到除菌的目的.常用于不宜高 压灭菌的物品。如：培养液、各种酶类等。4化学消毒法：利用消毒剂来消毒那些不能用物理方法消毒的物品和场地。最常见的是75%酒精及1的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。 5抗生素消毒：即抗生素灭菌，主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。17. 你认为细胞培养中微生物污染主要是通过那些途径导致的，并简要说明。(1)空气：空气是微生物传播的最主要途径。如净化工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可使净化工作不能正常进行

15、。工作时不戴口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽等使外界气流过强。污染空气可侵入操作野，造成污染。因此工作时减少空气流动是防止污染的重要环节。(2)器材：各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底，例如洗刷不干净污物残留及培养用液等灭菌不彻底都可以引入有害物质。另外需要注意的是CO2温箱由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，而CO2温箱内是开放式培养如不定期消毒,可形成污染. (3）操作：实验操作无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具或封瓶时不严，都可发生污染。培养两种以上细胞时，操作不规范、交叉使用吸管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。(4)血清：有些血清在生产时就

16、已被支原体或病毒等污染，即可成为污染的来源。 (5）组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘可以影响细胞生长。18.常用清洁液的配制成分有哪些？配制时需注意什么？（见表二）19.常用的胰蛋白酶的浓度是多少？应如何配制?如何终止其活性？胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，溶解及作用的最佳PH是89，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制，常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化

17、时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 （1）EDTA液：常用浓度为 0.02，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。（2）胰蛋白酶、EDTA:胰蛋白酶和EDTA联合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。（3）胶原酶：适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS或含血清的培养液配制，这样实验操作简便同时提高细胞成活率。但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为 200 Uml（约为 lmgml）或

18、 00303。最佳PH是6.5。20.名词解释： 细胞株 密度抑制 接触抑制 原代培养 传代1细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。2密度抑制（density inhibition）：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象3接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象。4原代培养（primary culture）：从体内取出细胞或组织的第一次培养。5传代（passage）也称再培养无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。21细

19、胞冻存与复苏的基本原则是什么？1慢冻快融2当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。3如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。22冻存液的作用是什么？（1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。（2）减少细胞被微生物污染的危险性。（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。降低人力和物力。23为什么细胞计数时，细胞

20、悬液逸出槽外时要重做？公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3 24. 在细胞培养中如何防止污染？（1）使用抗生素清除细菌和真菌。预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于用量510倍的冲洗法。于加药后作用2448小时，再换常规培养液。（2）用MRA（mycoplasma removal agent）处理细胞，每4天换一次液，连续处理15天清除支原体效果好。另外将受支原体污染的细胞放置在41作用510h最长

21、不超过18h，以杀灭支原体25. 培养细胞的生长测定方法1,细胞计数法2,台盼兰染色法3,MTT比色法4,细胞生长曲线法5,3H-TdR(3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法6,BrdU (5-bromo-2deoxyuridine，5-溴脱氧尿嘧啶核苷 ）掺入法26. 如何估计是否传代及传代的方式？估计:(1)细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代。(2)原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要注意观察及时进行处理。并可根据不同细胞对胰蛋白酶的不同耐受时间而分离和纯化所需要的细胞。另外，早期传代培养的细胞较已经建系

22、的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。 (3)首次传代时细胞接种数量要多一些使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。细胞传代过程需注意的问题：操作全过程注意无菌操作；胰酶消化时间要适度；吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡。在传代期培养时应注意：为保持二倍体细胞性质，细胞应在传代后早期冻存（不出10代内冻存）。少数细胞系在此期可能发生自发或诱发转化，获得不死性而成为无限细胞系，此时细胞核型多变成异倍体。方式:1.悬浮生长细胞传代.离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后 再混匀传代。直接传代法：

23、悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l223，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 .半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。27组织细胞取材及培养的基本要求1、取材的组织最好尽快培养。2、取材时应严格无菌操作。3、防止细胞机械损伤：取材和原代细胞制作时耍用锋利的器械，4、避免组织干燥：要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。5、原代培养，特别是正常细胞

24、的培养，应采用营养丰富的培养液。6、一般来讲胚胎组织较成熟个体的组织容易培 养分化低的较分化高的组织容易生长、肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。7、为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养与原组织的差异性原代取材时要同时留好组织学标本和电镜标本，并详细记录。28. 简述原代细胞培养方法及注意事项?常用的有两种: 细胞培养法 和 组织块法细胞培养法(1)按组织的消化分离法收获细胞。(2）在消化过程中可随时吸取少量消化液在镜下观察。(3)已过滤的消化液，800一1000rpm，低速离心5min后，去除上清，加含血清培养液，轻轻吹打形成细胞悬液。如果用胶原酶或

25、EDTA应先用缓冲液洗。组织块法（1）取材、修剪、组织剪或切成1mm3左右的小块。(2)将剪切好的组织小块用眼科镊送入培养瓶内。25ml培养瓶(底面积约为17.5cm2）以20一30小块为宜。(3）放置24h待组织小块贴附后将培养瓶慢慢翻转平放、静止培养。注意事项组织块接种后l3天，由于游出细胞数很少组织块的粘贴不牢固在观察相移动过程中要注意动作轻巧尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。在原代培养的1一2d内要持别注意观察，是否有细菌、霉菌的污染一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其它细胞带来污染。 对原代培养要及时观察发现细胞游出后要照像记录。原代培养35d需换液一次去除漂

26、浮的组织块和残留的血细胞，因为已漂浮的组织块及很多细胞碎片含有有毒物质，影响原代细胞的生长，要及时清除。注意事项:1组织块接种后l3天，由于游出细胞数很少组织块的粘贴不牢固在观察相移动过程中要注意动作轻巧尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。2在原代培养的1一2d内要持别注意观察，是否有细菌、霉菌的污染一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其它细胞带来污染。3原代培养35d需换液一次去除漂浮的组织块和残留的血细胞，因为已漂浮的组织块及很多细胞碎片含有有毒物质，影响原代细胞的生长，要及时清除。29判断细胞健康的标准是什么？1形态学2细胞染色体分析3同工酶检查4DNA指纹技术检测5

27、抗原标记6细胞生长实验30. 培养过程中支原体和病毒污染的特点是什么？支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2um，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染31.简述流式细胞术的基本概念。流式细胞术是二十世纪七十年代发展起来的高科学技术,流式细胞仪集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和

28、分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状, 还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞, 并收集、储存和处理数据, 进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度95%。与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。流式细胞仪的工作原理：待测样品制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗原等）染色后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，与此同时，不含细胞的磷酸

29、盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。32.阐述流式细胞仪的工作原理。 待测样品制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗原等）染色后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，与此同时，不含细胞的磷酸盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速

30、流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。 33.细胞经过荧光染色，在流式细胞仪的激光束照射下，会产生哪三大信号？这三大信号分别代表什么？1前向角散射

31、，即FSC，与细胞直径成正相关，所以我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。 2 侧向角散射，即SSC，是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息. 这两种信号同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收。前向光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小。3荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模数转换

32、器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。34.在流式细胞仪检测中，鞘液有哪些作用？鞘液的作用有二：一是约束样品使之在喷嘴中心以提高测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包裹下由流动室下面的喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂直的方向设置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细

33、胞的荧光信号变成电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。35.在流式细胞仪样品制备中，评价一个样品制备的优劣，有哪三个评价指标？细胞的密度，不能低于1106/ml 非特异荧光，不超过1.细胞碎片和聚集体，不能出现肉眼可见的团块。36.列举流式细胞仪在生物医学中的应用。1HLA-B27分析2细胞周期分析3凋亡分析4淋巴细胞亚群分析5白血病分型6细胞因子分析7血小板分析8干细胞分析9流式细胞仪在其它方面的应用37.简述流式细胞仪检测HLA-B27软件的工作原理。HLA-B27基因表达在所有含核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面含量丰富。HLA-B27软件首先在FSC-FL2的点图上确定CD3强阳性细胞

34、群体的位置，设定一个CD3+T淋巴细胞门，然后再根据FSC设定光散射门，去除FSC过大或过小的细胞，确保门内至少有50%的CD3+T淋巴细胞，这样通过二者的结合，将随后进行的分析严格地定位在T淋巴细胞上。在检测之前，仪器已经CaliBRITE beads和HLA-B27 calibration beads调试成功，并通过试剂批号的后缀确定了decision marker的位置。38.简述流式细胞仪检测HLA-B27的实验步骤。（见表三）39.流式细胞仪分析的主软件名称？校准仪器的软件名称？流式细胞仪数据显示通常有哪几种方式？主软件CELLQuest.仪器自动校检软件FACSComp.存的数据文

35、件虽然易于加工、处理、分析，但由于数据大，又缺乏直观性，不利于观察各参数及其相互的关系。因此，将数据用图形显 示更直观，然后再进行统计分析，这是FCM结果分析中最常用的分析方法。FCM数据显示通常有一维直方图、二维点图、二维密度图、二维等高图、假三维图等。40.FACSCalibur流式细胞仪（安装488和635nm激光）能同时检测到的六大参数分别是什么？41. 简述流式细胞仪的特点和检测范围。1分析速度快2 多参数3当代最先进的细胞定量分析技术4精度高细胞结构1细胞大小2细胞粒度3细胞表面面积4核浆比例5DNA含量与细胞周期6RNA含量7蛋白质含量.细胞功能1细胞表面/胞浆/核的特异性抗原2

36、细胞活性3细胞内细胞因子4酶活性5激素结合位点6细胞受体42. 在使用流式细胞仪进行分析时，为什么要进行光谱重叠的校正？当细胞携带两种荧光素如PE和FITC, 受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上，可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品或荧光小珠，可合理设置荧光信号的补偿值。 43. 简述磷脂酰丝氨酸外翻分析(A

37、nnexin V法)联合PI法检测细胞凋亡的原理。磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能

38、够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将正常细胞、凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开主要是通过PI与细胞核DNA结合，测定细胞内DNA含量。亚二倍体峰的出现，实际上是由于细胞凋亡时DNA含量低于正常细胞，使其在直方图上表现为一个荧光强度比正常细胞要小的峰（亚二倍体峰），即凋亡细胞DNA对PI可染性降低。44. 简述TUNEL法检测细胞凋亡的实验原理细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 的染色体DNA在Ca +和Mg+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被

39、随机切断，形成180200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。45. 简述流式细胞术PI染色进行细胞周期分析的原理? PI ,即碘化丙锭 ,可以与细胞内DNA和RNA结合 ,采用RNA抑制剂将RNA消化后 ,通过

40、流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同 ,通常正常细胞的G1 /G0期具有二倍体细胞的DNA含量 (2N) ,而G2 /M期具有四倍体细胞的DNA含量 (4N) ,而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此 ,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时 ,可以将细胞周期各时相区分为G1 /G0期 ,S期和G2 /M期 ,并可通过特殊软件计算各时相的百分率。值得注意的是 ,PI不能通过细胞膜完整的细胞46、细胞凋亡：凋亡（或程序性细胞死亡）是一个生理性的细胞自我毁灭的过程，在胚胎发育、生物体内环境的稳定及多

41、细胞生物防御外在及内在伤害方面均起着非常重要的作用。凋亡过程的紊乱，可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性变及局部损伤等。能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、能够引起染色体损伤的药物、细胞自身表达的一些受体分子等。 47、显微结构:，细胞膜保持完整一直到形成凋亡小体, 染色质聚集、分块、位于核膜上呈半月状，细胞器无明显变化,细胞体积固缩变小,凋亡小体形成48、凋亡小体49、细胞坏死:胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂在苏木精/伊红染色,胞质呈均一的深伊红色，原有的微细结构消失。50、荧光激发滤色镜分哪几类?

42、各自的激发波长是多少？激发滤色镜为观察不同性质的物体所设计的滤色镜或滤色镜组，通常可分为紫外激发(U激发)、紫色激发(V激发)、蓝色激发(B激发)和绿色激发(G激发)等四种。51、简述细细胞凋亡的形态学特征有哪些？（见表四）染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂， 凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症；凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质。核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成约200bp整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状；凋亡通常是生理性变化 52、根据标本染色的不同如何选择滤光片：染

43、成蓝色或绿色的标本使用红色滤光片、染成红色的标本使用绿色滤光片、染成黄色或棕色的标本使用蓝色滤光片、染成紫色的标本使用绿色滤光片、染成蓝紫色的标本使用黄色滤光片53、细胞凋亡的生物学意义。细胞凋亡作为生理性主动性的过程，能确保正常生长，发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能。54、荧光显微镜使用的注意事项：1)长时间的激发光照射标本，会发生荧光衰减和消失现象，故应尽可能缩短照射(观察)时间。暂时不观察时，可用挡板遮盖激发光源。2)在油浸观察时，应采用“无荧光油”，在使用U和V激发方式观察时更应注意。香柏油可产生青色荧光。3)标本所发的荧光较弱，观察时应尽可能在较暗的室内条件下进行。使用带有遮

44、光罩的目镜时可将其拨出使用，以防杂光进人干扰。4)荧光显微照相时，因曝光时间相对较长，可采用感光度较快的胶片 5)避免直视紫外线光源，将紫外线防护板(黄色)装在载物台前以防紫外线损伤视网膜。 6)电源应装置稳压器，电压不稳会降低汞灯的使用寿命并影响镜检效果。7)汞灯光源点亮后至少点灯15分，关闭后等待3-5分再开55、光学显微镜基本结构光学显微镜在结构上分为光学系统和机械装置两个部分。 光学系统主要包括目镜、物镜、聚光器、光阑及光源等部分。机械装置主要包括镜筒、镜柱、载物台、镜座、粗细调节螺旋等部分56、荧光显微镜在细胞生物学研究中有什么应用？57、比较放大率与分辨率的含义。放大率就是放大倍数

45、，是指被检物体经物镜、目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小与原物体大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积，如目镜为 10倍，物镜为40倍，则放大倍数为 40 X 10倍（放大400倍）。好的显微镜最大可放大2000倍，可分辨相距1X106cm的两点。分辨率又称“鉴别率”或“分辨本领”，是衡量显微镜性能的一个重要参数。正常人眼在照明良好的情况下，能分辨0.073mm距离的两物体点，若小于这个距离，就分辨不清是两个物体点，而被误认为是一点。因此，0.073mm为人眼的最小分辨距离。显微镜也是如此，其最小分辨距离也是有一定限度的。58、试论述细胞凋亡的检测方法。Annexin V联合PI法。TUN

46、EL法。细胞凋亡的主要检查手段。形态学检查 Ladders实验 流式细胞仪检查 Annexin V联合PI检测细胞凋亡。TUNEL法检测细胞凋亡细胞凋亡和细胞坏死的区别：起因 细胞凋亡是生理或病理性的；细胞坏死是病理性变化或剧烈损伤。范围 细胞凋亡是单个散在的细胞；细胞坏死是大片组织或成群细胞。细胞膜 细胞凋亡是保持完整一直到形成调亡小体；细胞坏死是破损。染色质是凝聚在核膜下呈半月状；细胞坏死呈絮状。细胞器 细胞凋亡无明显变化；细胞坏死是肿胀和内质网崩解。细胞体积 细胞凋亡时固缩变小；细胞坏死时肿胀变大。凋亡小体 细胞凋亡有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬；细胞坏死无，细胞自溶。基因组DNA 细胞凋亡有控降解，电泳图谱呈梯状；细胞坏死随机降解，电泳图谱呈涂抹状。蛋白质合成 细胞凋亡有；细胞坏死无。调节过程 细胞凋亡受基因控制；细胞坏死被动进行。炎症反应 细胞凋亡无，不释放细胞内容物；细胞坏死有，释放内容物。